2016年[ 技術開発研究助成 (開発研究) ] 成果報告 ： 年報第30号
hERG チャネル組込シリコンチップに基づく薬物副作用評価に関する研究
概要
１．はじめに
細胞膜中に存在する種々の膜タンパク質は細胞膜の高度な物質認識能を担っており、創薬の重要なターゲットでもある。1) 中でもイオンチャネルタンパク質は、その名の通り、絶縁膜の細胞膜中にイオンの通り道（チャネル）を形成する機能を持った膜タンパク質であり、現在の創薬ターゲットの中で 2 番目に大きい割合を占めている。さらに近年、重篤な副作用を頻発するイオンチャネルが心筋に見つかり、新薬開発において、このhuman ether-a-go-go-related gene（hERG）チャネルに対する臨床試験前の in vitro での副作用評価が必須となったことから、イオンチャネル電流を記録し評価することの重要性が高まっている。特に
図１ hERG チャネルと薬物副作用
hERG チャネルは、多種多様な薬物と副作用的に反応して不整脈を誘発し（図１）、時に突然死をも引き起こすことから、これまでに多くの医薬品がhERG チャネルへの副作用により市場から撤退してきた。現行では、生体膜中の hERG チャネル電流を記録するオートパッチクランプ法が主に用いられているが、細胞の状態の影響を受けやすく、状態のよい細胞からでないと記録できないという問題点を抱えている。そのため、細胞の状態の影響を受けない、新しいhERG チャネル副作用評価系の開発が強く望まれている。
細胞膜構造を人工的に形成した平面脂質二分子膜にイオンチャネルタンパク質を組み込んだ人工膜再構成系は、従来から、パッチクランプ法に相補的なチャネル評価系として期待されてきたが、膜の脆弱性が課題であった。2)、 3) 一方我々は、シリコン（Si）チップ中に作製した微細孔中での膜形成を行うことにより、安定性の著しく向上した脂質二分子膜を構築できることを見出した。4)、5) さらに、この安定な膜中に hERG チャネルを包埋し、チャネル電流に基づく薬物副作用の評価にも成功している。6) しかし、イオンチャネルの脂質二分子膜中への包埋は極めて困難であり、チャネル電流を記録できる確率は約６％と極めて低いことが新たな課題として判明した。したがって、今後の展開として hERG チャネル組込二分子膜をアレイ化した high-throughput 副作用評価系へと発展させるためには、脂質二分子膜中へのイオンチャネルの包埋確率の向上が必要不可欠である。また、副作用評価系としての信頼性の評価のため、人工脂質二分子膜系における副作用のデータと従来のパッチクランプ法によるデータの比較・検討も必要である。本研究では、人工脂質二分子膜系の測定スループットの向上を目指し、イオンチャネル包埋確率の向上のための新しい方法の開発を行うとともに、アレイ型測定系の構築を行う。また、パッチクランプ法による測定系を立ち上げ、本手法に基づく副作用評価と従来の方法（パッチクランプ法）による副作用評価との比較を行い、パッチクランプ法に相補的な新しい副作用評価系として確立を目指す。
２．実験方法
2.1 シリコンチップの微細加工と脂質二分子膜形成
図２（a）に、本研究で用いた微細加工シリコンチップの加工プロセスを示す。窒化ケイ素（Si3N4） 膜（厚さ: 200－240 nm）を積層した Si 基板を用い、フォトリソグラフィ及び等方性ウェットエッチングを行って直径 20-60 μm の微細孔を作製した。安定化の鍵となるのは、微細孔の縁部の形状である。図２（b）のように、縁部にナノスケールのテーパーのついた構造を形成することにより、脂質膜と保持体（Si3N4 膜）との間の歪みを減らすことにより、機械的強度の高い脂質二分子膜を形成することができる。低ノイズ測定用のシリコンチップを作製する場合は、さらにこの基板を熱酸化した後、微細孔以外のチップ表面をテフロン AF でコーティングしてチップ全体の低容量化を行った。7) このようにして作製したシリコンチップの表面を、3-cyanopropyldimethylchlorosilane で処理して疎水化した後、微細孔の中で脂質分子の単分子膜をはり合わせることで脂質二分子膜を形成した（図３）。
図２ (a) 微細加工シリコンチップの加工プロセスと(b) 微細孔縁部の SEM 画像と模式図
（a）(1) 熱酸化およびスパッタリング，(2) パターニングと異方性エッチング，(3) スパッタリング，
(4) パターニングと等方性エッチング，(5) SiO2 層の除去，(6) 熱酸化，SU8 層への押しつけ，
(7) スピンコート，(8) リフトオフ．
図３ 測定系の模式図
図４
2.2 hERG チャネルの抽出
hERG チャネルを発現した細胞（Channelopathy Foundation、スイス）を、Channelopathy Foundation 社のマニュアルに従って培養した後、細胞を破砕して遠心分離を行い、膜画分を抽出した（図４）。得られた懸濁液をボルテックスミキサーにかけることにより、プロテオリポソームを調製し、４℃で保存した。同様に、電位依存性 Na チャネル（Nav1.5）、γ アミノ酪酸（GABA）受容体チャネル（GABAR）を各チャネルの発現細胞より膜画分として抽出してプロテオリポソームを調製した。
2.3 チャネル電流の測定
2.1 の方法により脂質二分子膜を形成した後、二分子膜の片側の水溶液相に 2.2 で調製したチャネル含有プロテオリポソームを種々の条件下で添加して、脂質二分子膜中へのチャネルの包埋について検討した。チャネル包埋確率は、チャネル電流を記録できた確率として評価した。チャネル電流については、米国 Axon 社製の微小電流計測器 Axopatch 200B を用いて計測を行った。
３．結果と考察
3.1 脂質二分子膜へのイオンチャネル包埋確率の向上
脂質二分子膜へのイオンチャネルの包埋は、人工膜イオンチャネル再構成系の構築において最も困難なプロセスであった。通常、イオンチャネルタンパク質は、脂質膜に包まれたプロテオリポソームの状態で抽出・保存され、あらかじめ形成した二分子膜とリポソームとの膜融合（ベシクル融合）によって脂質二分子膜へと包埋される（図５）。このベシクル融合の起こる確率が極めて低いことが脂質二分子膜再構成の大きな課題の一つであった。一方、ベシクル融合現象は、細胞か
図５ ベシクル融合の模式図
図６ 遠心力によるプロテオリポソーム駆動力の評価．孔無しシリコンチップの遠心後の原子間力顕微鏡像
らの物質分泌において進行する開口放出（エクソサイトーシス）のモデル系でもあることからも注目を集めており、これまでにいくつかの中間状態が報告されている。特にZimmerbergらはその中間状態の数について詳細な検討を行い、系に加えられたプロテオリポソームの16％程度しか脂質二分子膜表面に達しておらず、その大多数が膜近傍にすら到達できていないことを報告している。8) 我々は、この報告に着目し、リポソームの脂質二
分子膜へのアクセスを促進することにより、ベシクル融合確率を向上させることができれば、イオンチャネルの包埋確率およびチャネル電流の記録確率を向上できるのではないかと考えた。そこで、膜融合過程において遠心力をかけることができるように測定系を構築し、遠心力によるチャネル包埋促進について検討を行った。始めに、微細孔を形成していないシリコンチップを用いて測定用チャンバーに装着して遠心を行い、遠心後の
図(a)(b) (c)
図７ 本手法のベシクル融合促進によって記録したチャネル電流の例．(a) hERG チャネル電流，(B)Nav1.5 チャネル電流，(c) GABAAR チャネル電流
シリコンチップの表面状態について原子間力顕微鏡による観察を行った。その結果、14 x g以上の遠心力によって、チャネル含有プロテオリポソームを脂質二分子膜表面にまで輸送できることを確認した（図６）。次に、hERGチャネルを対象にこの遠心条件(14-55 x g)によるチャネル包埋促進について検討した結果、約70％の確率でチャネル電流を記録することができた（図７）。さらに、同様の遠心力に基づくチャネル包埋促進について検討した結果、他のヒト由来のチャネル、すなわち電位依存性チャネルのNav1.5チャネルや、リガンド作動性チャネルの GABAA 受容体（GABAAR）のチャネルの効率的な包埋に成功し、約70％の高い確率で図５のようなチャネル電流 を記録できるようになった。9) 観測された電流は、特異的阻害剤によって阻害され、また、各チャネル特有のシングルチャネルコンダクタンスを示 した。3種のチャネルのチャネル電流記録確率は、約70％（測定数の合計n=27）であり、従来の撹拌 による記録確率（約6％）に比べて著しい向上が 見られた。次に、プロテオリポソームの粒径分布 を測定し、その結果に基づいてプロテオリポソー ムにかかる遠心力を見積もったところ、10-3－10-2pNの極めて小さい力であることが分かった。この遠心力の大きさは、近接したリポソーム間のベシクル融合に必要な力の報告値（100-500 pN）10)に比べて104－105倍も小さかった。この結果は、遠心力による膜融合促進が、膜融合過程自体の促進というよりも、プロテオリポソームの脂質二分子膜へのアクセスの促進によるものであることを示唆している。これにより、膜近傍のプロテオリポソーム濃度が増大し、ベシクル融合に至るプロテオリポソーム数の増大につながったものと考えられる。遠心力の負荷によりイオンチャネルの包埋を促進する本アプローチは、アレイ測定系との融合も可能であり、今後のhigh throughput薬物スクリーニング法への展開が期待される。
3.2 アレイ測定系への展開
イオンチャネルを対象とする薬物スクリーニング法や副作用評価法においては、対象となる候補化合物の数が膨大になることから、1 度の実験で多サンプルを評価できるハイスループットな解析系が必要とされる。我々は、多数のチップの同時作製が容易という半導体微細加工の特徴を活かし、上述のチップを多数個並列に並べたイオンチャネルアレイの構築を進めている。これまでに、プロトタイプとして 9 枚脂質二分子膜アレイの構築と、複数の測定ウェルからのチャネル電流の同時測定に成功しているが、11) 膨大な数の候 補医薬品のスクリーニングを考えると、更なるスループットの向上は必要不可欠である。我々は、生化学反応でよく用いられる 96 ウェルプレートに着目し、この構造を参考にした 96 ウェル型同時測定系の構築に着手した。96 ウェルを 16 個に分割し、上述の遠心力によるベシクル融合促進とも結合可能な 16×6 型の構造を設計し、図８のような 16 ウェル型構造の構築に成功している。今後は、この系を用いた副作用評価の定量化を目指していきたいと考えている。
図８ アレイ測定系の模式図．(a) 俯瞰図，
(b)断面図
微細加工シリコンチップに基づく副作用評価法の確立を目指し、チャネル包埋促進とハイスループット測定系の構築を進めると同時に、本研究では、現行法であるパッチクランプ法との比較についても検討を開始している。現在までに、オートパッチクランプ法の測定環境の立ち上げを行い、 hERG チャネル発現細胞からのwhole-cell 電流を記録できるようになっている。今後はこれをさらに進め、パッチクランプ法に基づいて決定した副作用の数値（IC50）と、人工脂質二分子膜再構成系を用いて評価した数値（IC50） との定量的比較を行い、信頼性のある副作用評価系の構築へと発展させたいと考えている。
４．まとめ
我々は、これまでに微細加工技術と脂質二分子 膜形成の融合により、脂質二分子膜の耐久性およ び機械的強度を著しく向上させ、その膜中への生 体チャネルの組込について報告してきたが、その 包埋確率が極めて低いことが、今後の発展への障 害となっていた。本研究では、この包埋効率の問 題に取り組み、遠心力を駆動力とすることにより、 hERG チャネル、Nav1.5 チャネル、GABA 受容体チャネルといった様々なゲーティング機構をも つイオンチャネルタンパク質を脂質二分子膜中 に高確率で包埋することに成功した。遠心力を利 用することのメリットは、イオンチャネル活性と の適合性の高さにある。膜タンパク質の中でも最も脆弱と言われるイオンチャネルタンパク質を 対象とする場合、包埋方法によっては、チャネル 活性が損なわれてしまう危険性がある。一方、遠 心力の場合は、チャネルタンパク質の抽出にも用 いられており、チャネルタンパク質との適合性は 極めて高い。また、従来のベシクル融合促進法（浸 透圧法やナイスタチン法）との融合も可能であり、さらなる融合促進も期待される。その一方で、 我々はハイスループット測定のためのアレイ測 定系の構築も進めており、96 ウェル型構造によるハイスループットhERG チャネルアレイの構築と、
それに基づく薬物副作用評価系の確立も近いと考えている。
細胞膜中に存在する種々の膜タンパク質は細胞膜の高度な物質認識能を担っており、創薬の重要なターゲットでもある。1) 中でもイオンチャネルタンパク質は、その名の通り、絶縁膜の細胞膜中にイオンの通り道（チャネル）を形成する機能を持った膜タンパク質であり、現在の創薬ターゲットの中で 2 番目に大きい割合を占めている。さらに近年、重篤な副作用を頻発するイオンチャネルが心筋に見つかり、新薬開発において、このhuman ether-a-go-go-related gene（hERG）チャネルに対する臨床試験前の in vitro での副作用評価が必須となったことから、イオンチャネル電流を記録し評価することの重要性が高まっている。特に
図１ hERG チャネルと薬物副作用
hERG チャネルは、多種多様な薬物と副作用的に反応して不整脈を誘発し（図１）、時に突然死をも引き起こすことから、これまでに多くの医薬品がhERG チャネルへの副作用により市場から撤退してきた。現行では、生体膜中の hERG チャネル電流を記録するオートパッチクランプ法が主に用いられているが、細胞の状態の影響を受けやすく、状態のよい細胞からでないと記録できないという問題点を抱えている。そのため、細胞の状態の影響を受けない、新しいhERG チャネル副作用評価系の開発が強く望まれている。
細胞膜構造を人工的に形成した平面脂質二分子膜にイオンチャネルタンパク質を組み込んだ人工膜再構成系は、従来から、パッチクランプ法に相補的なチャネル評価系として期待されてきたが、膜の脆弱性が課題であった。2)、 3) 一方我々は、シリコン（Si）チップ中に作製した微細孔中での膜形成を行うことにより、安定性の著しく向上した脂質二分子膜を構築できることを見出した。4)、5) さらに、この安定な膜中に hERG チャネルを包埋し、チャネル電流に基づく薬物副作用の評価にも成功している。6) しかし、イオンチャネルの脂質二分子膜中への包埋は極めて困難であり、チャネル電流を記録できる確率は約６％と極めて低いことが新たな課題として判明した。したがって、今後の展開として hERG チャネル組込二分子膜をアレイ化した high-throughput 副作用評価系へと発展させるためには、脂質二分子膜中へのイオンチャネルの包埋確率の向上が必要不可欠である。また、副作用評価系としての信頼性の評価のため、人工脂質二分子膜系における副作用のデータと従来のパッチクランプ法によるデータの比較・検討も必要である。本研究では、人工脂質二分子膜系の測定スループットの向上を目指し、イオンチャネル包埋確率の向上のための新しい方法の開発を行うとともに、アレイ型測定系の構築を行う。また、パッチクランプ法による測定系を立ち上げ、本手法に基づく副作用評価と従来の方法（パッチクランプ法）による副作用評価との比較を行い、パッチクランプ法に相補的な新しい副作用評価系として確立を目指す。
２．実験方法
2.1 シリコンチップの微細加工と脂質二分子膜形成
図２（a）に、本研究で用いた微細加工シリコンチップの加工プロセスを示す。窒化ケイ素（Si3N4） 膜（厚さ: 200－240 nm）を積層した Si 基板を用い、フォトリソグラフィ及び等方性ウェットエッチングを行って直径 20-60 μm の微細孔を作製した。安定化の鍵となるのは、微細孔の縁部の形状である。図２（b）のように、縁部にナノスケールのテーパーのついた構造を形成することにより、脂質膜と保持体（Si3N4 膜）との間の歪みを減らすことにより、機械的強度の高い脂質二分子膜を形成することができる。低ノイズ測定用のシリコンチップを作製する場合は、さらにこの基板を熱酸化した後、微細孔以外のチップ表面をテフロン AF でコーティングしてチップ全体の低容量化を行った。7) このようにして作製したシリコンチップの表面を、3-cyanopropyldimethylchlorosilane で処理して疎水化した後、微細孔の中で脂質分子の単分子膜をはり合わせることで脂質二分子膜を形成した（図３）。
図２ (a) 微細加工シリコンチップの加工プロセスと(b) 微細孔縁部の SEM 画像と模式図
（a）(1) 熱酸化およびスパッタリング，(2) パターニングと異方性エッチング，(3) スパッタリング，
(4) パターニングと等方性エッチング，(5) SiO2 層の除去，(6) 熱酸化，SU8 層への押しつけ，
(7) スピンコート，(8) リフトオフ．
図３ 測定系の模式図
図４
2.2 hERG チャネルの抽出
hERG チャネルを発現した細胞（Channelopathy Foundation、スイス）を、Channelopathy Foundation 社のマニュアルに従って培養した後、細胞を破砕して遠心分離を行い、膜画分を抽出した（図４）。得られた懸濁液をボルテックスミキサーにかけることにより、プロテオリポソームを調製し、４℃で保存した。同様に、電位依存性 Na チャネル（Nav1.5）、γ アミノ酪酸（GABA）受容体チャネル（GABAR）を各チャネルの発現細胞より膜画分として抽出してプロテオリポソームを調製した。
2.3 チャネル電流の測定
2.1 の方法により脂質二分子膜を形成した後、二分子膜の片側の水溶液相に 2.2 で調製したチャネル含有プロテオリポソームを種々の条件下で添加して、脂質二分子膜中へのチャネルの包埋について検討した。チャネル包埋確率は、チャネル電流を記録できた確率として評価した。チャネル電流については、米国 Axon 社製の微小電流計測器 Axopatch 200B を用いて計測を行った。
３．結果と考察
3.1 脂質二分子膜へのイオンチャネル包埋確率の向上
脂質二分子膜へのイオンチャネルの包埋は、人工膜イオンチャネル再構成系の構築において最も困難なプロセスであった。通常、イオンチャネルタンパク質は、脂質膜に包まれたプロテオリポソームの状態で抽出・保存され、あらかじめ形成した二分子膜とリポソームとの膜融合（ベシクル融合）によって脂質二分子膜へと包埋される（図５）。このベシクル融合の起こる確率が極めて低いことが脂質二分子膜再構成の大きな課題の一つであった。一方、ベシクル融合現象は、細胞か
図５ ベシクル融合の模式図
図６ 遠心力によるプロテオリポソーム駆動力の評価．孔無しシリコンチップの遠心後の原子間力顕微鏡像
らの物質分泌において進行する開口放出（エクソサイトーシス）のモデル系でもあることからも注目を集めており、これまでにいくつかの中間状態が報告されている。特にZimmerbergらはその中間状態の数について詳細な検討を行い、系に加えられたプロテオリポソームの16％程度しか脂質二分子膜表面に達しておらず、その大多数が膜近傍にすら到達できていないことを報告している。8) 我々は、この報告に着目し、リポソームの脂質二
分子膜へのアクセスを促進することにより、ベシクル融合確率を向上させることができれば、イオンチャネルの包埋確率およびチャネル電流の記録確率を向上できるのではないかと考えた。そこで、膜融合過程において遠心力をかけることができるように測定系を構築し、遠心力によるチャネル包埋促進について検討を行った。始めに、微細孔を形成していないシリコンチップを用いて測定用チャンバーに装着して遠心を行い、遠心後の
図(a)(b) (c)
図７ 本手法のベシクル融合促進によって記録したチャネル電流の例．(a) hERG チャネル電流，(B)Nav1.5 チャネル電流，(c) GABAAR チャネル電流
シリコンチップの表面状態について原子間力顕微鏡による観察を行った。その結果、14 x g以上の遠心力によって、チャネル含有プロテオリポソームを脂質二分子膜表面にまで輸送できることを確認した（図６）。次に、hERGチャネルを対象にこの遠心条件(14-55 x g)によるチャネル包埋促進について検討した結果、約70％の確率でチャネル電流を記録することができた（図７）。さらに、同様の遠心力に基づくチャネル包埋促進について検討した結果、他のヒト由来のチャネル、すなわち電位依存性チャネルのNav1.5チャネルや、リガンド作動性チャネルの GABAA 受容体（GABAAR）のチャネルの効率的な包埋に成功し、約70％の高い確率で図５のようなチャネル電流 を記録できるようになった。9) 観測された電流は、特異的阻害剤によって阻害され、また、各チャネル特有のシングルチャネルコンダクタンスを示 した。3種のチャネルのチャネル電流記録確率は、約70％（測定数の合計n=27）であり、従来の撹拌 による記録確率（約6％）に比べて著しい向上が 見られた。次に、プロテオリポソームの粒径分布 を測定し、その結果に基づいてプロテオリポソー ムにかかる遠心力を見積もったところ、10-3－10-2pNの極めて小さい力であることが分かった。この遠心力の大きさは、近接したリポソーム間のベシクル融合に必要な力の報告値（100-500 pN）10)に比べて104－105倍も小さかった。この結果は、遠心力による膜融合促進が、膜融合過程自体の促進というよりも、プロテオリポソームの脂質二分子膜へのアクセスの促進によるものであることを示唆している。これにより、膜近傍のプロテオリポソーム濃度が増大し、ベシクル融合に至るプロテオリポソーム数の増大につながったものと考えられる。遠心力の負荷によりイオンチャネルの包埋を促進する本アプローチは、アレイ測定系との融合も可能であり、今後のhigh throughput薬物スクリーニング法への展開が期待される。
3.2 アレイ測定系への展開
イオンチャネルを対象とする薬物スクリーニング法や副作用評価法においては、対象となる候補化合物の数が膨大になることから、1 度の実験で多サンプルを評価できるハイスループットな解析系が必要とされる。我々は、多数のチップの同時作製が容易という半導体微細加工の特徴を活かし、上述のチップを多数個並列に並べたイオンチャネルアレイの構築を進めている。これまでに、プロトタイプとして 9 枚脂質二分子膜アレイの構築と、複数の測定ウェルからのチャネル電流の同時測定に成功しているが、11) 膨大な数の候 補医薬品のスクリーニングを考えると、更なるスループットの向上は必要不可欠である。我々は、生化学反応でよく用いられる 96 ウェルプレートに着目し、この構造を参考にした 96 ウェル型同時測定系の構築に着手した。96 ウェルを 16 個に分割し、上述の遠心力によるベシクル融合促進とも結合可能な 16×6 型の構造を設計し、図８のような 16 ウェル型構造の構築に成功している。今後は、この系を用いた副作用評価の定量化を目指していきたいと考えている。
図８ アレイ測定系の模式図．(a) 俯瞰図，
(b)断面図
微細加工シリコンチップに基づく副作用評価法の確立を目指し、チャネル包埋促進とハイスループット測定系の構築を進めると同時に、本研究では、現行法であるパッチクランプ法との比較についても検討を開始している。現在までに、オートパッチクランプ法の測定環境の立ち上げを行い、 hERG チャネル発現細胞からのwhole-cell 電流を記録できるようになっている。今後はこれをさらに進め、パッチクランプ法に基づいて決定した副作用の数値（IC50）と、人工脂質二分子膜再構成系を用いて評価した数値（IC50） との定量的比較を行い、信頼性のある副作用評価系の構築へと発展させたいと考えている。
４．まとめ
我々は、これまでに微細加工技術と脂質二分子 膜形成の融合により、脂質二分子膜の耐久性およ び機械的強度を著しく向上させ、その膜中への生 体チャネルの組込について報告してきたが、その 包埋確率が極めて低いことが、今後の発展への障 害となっていた。本研究では、この包埋効率の問 題に取り組み、遠心力を駆動力とすることにより、 hERG チャネル、Nav1.5 チャネル、GABA 受容体チャネルといった様々なゲーティング機構をも つイオンチャネルタンパク質を脂質二分子膜中 に高確率で包埋することに成功した。遠心力を利 用することのメリットは、イオンチャネル活性と の適合性の高さにある。膜タンパク質の中でも最も脆弱と言われるイオンチャネルタンパク質を 対象とする場合、包埋方法によっては、チャネル 活性が損なわれてしまう危険性がある。一方、遠 心力の場合は、チャネルタンパク質の抽出にも用 いられており、チャネルタンパク質との適合性は 極めて高い。また、従来のベシクル融合促進法（浸 透圧法やナイスタチン法）との融合も可能であり、さらなる融合促進も期待される。その一方で、 我々はハイスループット測定のためのアレイ測 定系の構築も進めており、96 ウェル型構造によるハイスループットhERG チャネルアレイの構築と、
それに基づく薬物副作用評価系の確立も近いと考えている。