2015年[ 中谷賞 ] ： 年報第29号
電子線励起微小光源を用いた超解像光学顕微鏡の開発
概要
１．はじめに
バイオテクノロジーなどの技術の進展とともに、生体試料を高分解能で観察したいとの要求が高まっている。サブミクロンから数十ナノメートルの分解能で微小細胞の機能、細胞間の相互作用などの観察が期待されている。これらの要求に応えるため、原子間力顕微鏡(AFM)などのプローブ走査顕微鏡、走査型電子顕微鏡(SEM)などを用いて生体試料を観察する技術の開発が進められている。これらの顕微鏡は、非常に高い空間分解能を有しており、非常に有効なツールであるが、一方では真空が必要であったり、試料が導電性の物質に限られるなど、生体試料を生きたまま観察することが困難な場合も多い。
光学顕微鏡は、STM, AFM などに比べて分解能では劣るものの、扱いやすく、水中でも試料を観察できるなど、多くの特徴を有している。また、より高分解能を目指して、近接場（ニアフィールド）光学顕微鏡の開発も盛んに進められている。これらの技術の進展とともに光学顕微鏡は、今後のナノフォトニクスとバイオテクノロジーを融合した、ナノバイオフォトニクス分野において非常に有効に利用されていくものと考える。
本研究では、電子線により蛍光膜上に微小光源を励起し走査する、電子線励起アシスト(EXA:electron excitation assisted)光学顕微鏡を開発した1,2)。電子線は光に比べて微小な領域に集光できるため、光の回折限界以下の微小な光源を誘起できる。その光源で試料表面を走査すれば、従来の光学顕微鏡に比べて十分高い分解能を実現することが可能となる。
２．光学顕微鏡の進展
光学顕微鏡は、長い歴史をもち、様々な応用分野で試料の微細構造を観察する目的に用いられてきた。特に生物分野では、試料へダメージを与えることなく、生きたまま観察可能な手法として広く用いられてきた。
光学顕微鏡は、要素技術の性能向上により、分解能の向上が進められてきた。光源からの光をいかに明るくムラなく試料を照明するか、視野内の画像をいかに収差なく結像するかが検討され、輝度の高いハロゲン光源、ケラー照明系、収差補正高NA対物レンズなどが開発されてきた3)。
レーザーの発展と共に、光学顕微鏡にもレーザーが導入され、全く新しい展開がみられた。レーザー走査型顕微鏡の開発である4)。図1にレーザー走査型蛍光顕微鏡の構成を示す。レーザー光を試料の一点に集光し、レーザー光を走査することにより、画像をコンピュータ上で構成する。レーザー走査顕微鏡では、空間分解能は従来の光学顕微鏡と同じであるが、ある瞬間には試料の一点にのみ光を照射しているため、試料による迷光が減少し、コントラストが大きく向上する。さらに走査型光学系を導入することにより、従来の光学系では実現できなかった共焦点顕微鏡が開発された。
図2に共焦点蛍光顕微鏡の構成を示す。共焦点蛍光顕微鏡の構成は、図1のレーザー走査型蛍光顕微鏡の構成とほとんど同じであるが、検出器の直前にピンホールを配置することが大きな特徴である。ピンホールはレーザーの集光位置と共役な位置に配置する。このピンホールによって、試料のディフォーカスした位置からの蛍光を除去することができるため、分解能が向上するとともに、試料の3次元構造を観察することが可能となる5)。また、レーザー走査顕微鏡では強度の大きなレーザー光を一点に集光するため、フォーカス位置に非常に強度の大きなスポットを形成し、容易に非線形光学効果を利用したり、試料に刺激を与えたり加工したりすることが可能となった。
現在、光学顕微鏡において全く新しい展開が起こりつつある。単なる光学部品や光源などの性能向上にとどまらず、全く新しい原理に基づく、分解能向上への挑戦が始まっている。新規な蛍光プローブの開発により光制御機能を持たせたり、マルチカラー化したり、蛍光の飽和励起や誘導放出などを積極的に利用する方法が開発されている。また、電子線で微小な光源を励起したり、光で超音波を励起するなど、光以外の物理も取り込むことによって、従来の光学顕微鏡を超えた新しい光学顕微鏡が開発され、分解能が飛躍的に向上している。
例えば、PALM(photoactivation localization microscopy)6)またはSTORM (stochastic optical reconstruction microscopy)7)と呼ばれる顕微鏡では、光制御可能な蛍光プローブを用いて、分解能を飛躍的に向上させている。また、SAX(saturated excitation)顕微鏡では蛍光の飽和励起を積極的に使用している8,9) 。STED(stimulated emission depletion) 顕微鏡では蛍光の誘導放出により、集光スポットを等価的に小さくすることに成功している10)。図3にSTED顕微鏡の原理を示す。STED顕微鏡では、試料に励起光照射し、蛍光分子を励起する。これは通常の蛍光顕微鏡と全く同じプロセスである。超解像を実現するためにSTED顕微鏡では、励起光を照射した直後にドーナツ状の強度分布をもつSTED光を照射する。STED光が照射された領域の蛍光分子は、STED光により誘導放出が誘起され、STED光と同じ波長の光を放出する。したがって、励起光により励起された蛍光分子のうち、中心付近に存在しSTED光が照射されなかったものは、通常の蛍光寿命で蛍光分子の波長拡がりを持つ光を放出して緩和する。STED光以外の波長の蛍光を検出することにより、選択的に励起スポットの中心部分のみを観察することができ、高分解能を実現可能である。
現在、我々が開発を進めている電子線励起アシスト(EXA: electron excitation assisted)光学顕微鏡では、生物試料観察における光学顕微鏡の優位性と電子顕微鏡における高分解能性を融合した新しい光学顕微鏡である。従来の光学顕微鏡に比べて十分高い分解能を実現することが特徴である。
３．EXA顕微鏡の原理と特徴
図4に、我々が開発したEXA顕微鏡の原理を示す。本顕微鏡では、集束電子線により蛍光膜上に微小な点光源を励起する。蛍光薄膜上に試料を直接配置し、蛍光膜上の微小光源により試料を照明する。試料と蛍光薄膜の距離が十分小さい場合、電子線励起によって生じた微小蛍光光源のエバネッセント波で試料を観察することができ、回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。電子線を走査することにより、蛍光発光の領域を走査し、画像を取得する。
本システムでは、電子線によって微小な輝点を実現するため、観察系は通常のレーザー走査型光学顕微鏡と同様の結像システムとなる。したがって、既にこれまでに開発されてきた光学顕微鏡の光学系を検出システムに応用することによって、高い空間分解能と多くの機能を持つ検出システムを構築することが可能である。
また試料を配置する蛍光薄膜の部分で光学顕微鏡部と電子顕微鏡部が分離されるため、試料を配置する部分には真空や金属膜の蒸着などは全く必要なく、通常の光学顕微鏡と同様の環境で使用することが可能である。
本手法は次のような利点を有する。
1) ナノメートルオーダーの分解能を実現可能
電子線ビームを集光して蛍光薄膜を励起するため、光の回折限界によらない微小な点光源を実現することが可能である。そのため従来の光学顕微鏡の分解能を大きく超えた分解能を実現することが可能となる。
2) 生物試料の光学定数(吸収、屈折率分布)などで決まる光強度分布を観察可能
光学顕微鏡結像部分で検出されるのは、微小光源から試料を透過した光、または微小光源によって励起された蛍光強度分布である。したがって開発する顕微鏡システムでは、試料の光学定数分布を測定することが可能である。これは、X線による透過画像や電子顕微鏡による観察像、原子間力顕微鏡で試料の凹凸を観察するのとは、全く観察対象が異なる。
3) 電子線を走査するため高速な観察が可能
電子線を走査することにより、容易に微小光源を走査することができ、高速な観察が可能である。
4) 蛍光薄膜材料の選択による高機能化
いろいろな機能を持つ蛍光薄膜（発光波長特性、偏光特性、非線形光学応答など）を用いることによって、さまざまな機能を持つ光ナノイメージング手法を実現することが可能である。
４．EXA顕微鏡の開発
EXA顕微鏡では、電子線を伝搬させるための真空と試料を配置するための大気圧の環境を極薄の窒化シリコンを用いて分離した。窒化シリコンは、機械的強度が非常に強く、耐薬品性も優れている。そのため、非常に薄くしても、気圧に耐え、SEM鏡筒の真空を維持することができる。図５にEXA顕微鏡で用いた窒化シリコンを示す。膜厚は50 nm である。ウィンドウ部のサイズは、100 x 100 μm である。
EXA顕微鏡の空間分解能の評価をするため、窒化シリコン薄膜中での電子線の散乱をモンテカルロシミュレーションにより求めた。薄膜中での散乱は、EXA顕微鏡の空間分解能を決める重要なファクターである。図６に窒化シリコン薄膜中での電子線の散乱のシミュレーション結果を示す。窒化シリコン薄膜の厚さは、30, 50, 75 nm である。入射電子線の加速電圧は、1, 5, 10 kV である。電子線は、直径2nm のスポットサイズで薄膜上部に収束させた。この結果より、入射電子の加速電圧が高く、窒化シリコン薄膜の厚さが薄い場合に電子線の散乱が小さいことが分かる。加速電圧10kV、窒化シリコン膜厚50 nm の場合、電子線の散乱は薄膜裏面で12nm 幅である。この結果より、窒化シリコン薄膜中を用いることで、光の回折限界よりも小さいスポットを実現できることが分かる。
窒化シリコン薄膜を用いることで、電子線の散乱により光源を大きくすること無く、試料を大気圧下に設置することが可能となる。これにより、液中や様々なガス雰囲気中での試料観察が実現する。また、窒化シリコンに生体適合性のコーティングを行うことで、様々な細胞を培養することも可能である。
図７に分解能評価の基礎実験として、直径50nm のラテックスを観察した結果を示す。蛍光膜上に直接ラテックスを配置し、電子線で蛍光を励起した。図７(a)は検出した蛍光による観察画像、(b)は白線部分の強度プロファイルである。図７(a)の白線上に存在する4つ粒子がそれぞれ分離して観察されており、その強度分布も50 nm の半値幅となっている。この結果より本顕微鏡システムは50 nm 以下の分解能を有することが確認できる。
５．D-EXA顕微鏡の開発
我々は、EXA顕微鏡のもう一つの形態として、ラベリングした生物細胞を電子線で直接励起する高分解能顕微鏡(D-EXA: Direct electron beamexcitation assisted)の開発も進めている。図８にD-EXA顕微鏡の原理を示す。この顕微鏡では、大気圧と真空を分離する薄膜を、集光電子線を透過させ生物試料に直接照射し、ラベリングした蛍光分子を直接励起する。通常のレーザー走査蛍光顕微鏡において、レーザーで蛍光を励起する代わりに、透過電子線で励起する方法である。レーザーに比べて電子線は集光性が高いため、光の回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。この手法の利点は、(a)微小光源を実現するための蛍光膜が不要であること、(b)生物・医学分野でこれまで開発されてきた様々なラベリング手法が有効活用できること、(c)試料の自家蛍光を励起すればラベルフリーの観察が可能なことなどである。一方、生物試料に直接電子線を照射するためダメージが大きいこと、試料の深いところを観察すると電子線散乱により分解能が低下することなどが問題となる。
図9(a)にD-EXA顕微鏡により取得したチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO)の観察結果を示す。この試料は染色等の処理は行なっておらず、取得された蛍光は試料の自家蛍光によるものである。細胞内に存在する顆粒が高分解能かつ高コントラスで観察できていることがわかる。図9(b)には比較のための通常の位相差顕微鏡で取得した観察結果を示す。図9(b)は図9(a)と同じ場所を観察したものである。
６．まとめ
光学顕微鏡は、光学部品およびレーザー光源の高品質・高機能化による進展だけではなく、全く新しい原理に基づく高分解能化、高機能化が進められている。材料科学、電子線、超音波、プラズモン光学、画像処理、など様々な技術を組み合わせることにより、「光学顕微鏡の再発明」が進められている。
我々が開発を進めているEXA顕微鏡システムは、生物に優しい光学顕微鏡の特徴と非常に高い分解能を持つ電子顕微鏡のそれぞれの利点を融合した新しいイメージング手法である。収束電子線を蛍光体に照射し、光の回折限界より小さいナノ光源を生成する。光を利用するため、試料の屈性率、吸収係数、偏光特性の情報を取得することができる。また、蛍光薄膜を高機能化することで、試料の様々な光学情報を取得することが可能となる。紫外線により、細胞などの蛍光イメージングができる。また、白色光を発光させれば、分光特性を測ることができる。また、ドットアレイやナノホールアレイ11)構造を蛍光薄膜中に作製することにより、電子線の散乱を押さえ、より高い空間分解能が得られる。検出系は、光学顕微鏡を用いているため、これまでに開発されてきた光学顕微鏡の光学系を検出システムに応用することができる。高い空間分解能と多くの機能を持つ検出システムを構築することができる。
このような特徴を有するEXA顕微鏡により、これまで観察できなかった微小な領域の生命現象を明らかにすることが可能となり、ナノ・バイオテクノロジーに大きく寄与するものと考える。分光器、高速な検出器などとの組み合わせによる分光計測による定性分析、高速現象の時間分解計測を導入することで、医学・生物分野のみならず、電子工学分野、化学分野、製薬分野への応用展開も期待できる。
バイオテクノロジーなどの技術の進展とともに、生体試料を高分解能で観察したいとの要求が高まっている。サブミクロンから数十ナノメートルの分解能で微小細胞の機能、細胞間の相互作用などの観察が期待されている。これらの要求に応えるため、原子間力顕微鏡(AFM)などのプローブ走査顕微鏡、走査型電子顕微鏡(SEM)などを用いて生体試料を観察する技術の開発が進められている。これらの顕微鏡は、非常に高い空間分解能を有しており、非常に有効なツールであるが、一方では真空が必要であったり、試料が導電性の物質に限られるなど、生体試料を生きたまま観察することが困難な場合も多い。
光学顕微鏡は、STM, AFM などに比べて分解能では劣るものの、扱いやすく、水中でも試料を観察できるなど、多くの特徴を有している。また、より高分解能を目指して、近接場（ニアフィールド）光学顕微鏡の開発も盛んに進められている。これらの技術の進展とともに光学顕微鏡は、今後のナノフォトニクスとバイオテクノロジーを融合した、ナノバイオフォトニクス分野において非常に有効に利用されていくものと考える。
本研究では、電子線により蛍光膜上に微小光源を励起し走査する、電子線励起アシスト(EXA:electron excitation assisted)光学顕微鏡を開発した1,2)。電子線は光に比べて微小な領域に集光できるため、光の回折限界以下の微小な光源を誘起できる。その光源で試料表面を走査すれば、従来の光学顕微鏡に比べて十分高い分解能を実現することが可能となる。
２．光学顕微鏡の進展
光学顕微鏡は、長い歴史をもち、様々な応用分野で試料の微細構造を観察する目的に用いられてきた。特に生物分野では、試料へダメージを与えることなく、生きたまま観察可能な手法として広く用いられてきた。
光学顕微鏡は、要素技術の性能向上により、分解能の向上が進められてきた。光源からの光をいかに明るくムラなく試料を照明するか、視野内の画像をいかに収差なく結像するかが検討され、輝度の高いハロゲン光源、ケラー照明系、収差補正高NA対物レンズなどが開発されてきた3)。
レーザーの発展と共に、光学顕微鏡にもレーザーが導入され、全く新しい展開がみられた。レーザー走査型顕微鏡の開発である4)。図1にレーザー走査型蛍光顕微鏡の構成を示す。レーザー光を試料の一点に集光し、レーザー光を走査することにより、画像をコンピュータ上で構成する。レーザー走査顕微鏡では、空間分解能は従来の光学顕微鏡と同じであるが、ある瞬間には試料の一点にのみ光を照射しているため、試料による迷光が減少し、コントラストが大きく向上する。さらに走査型光学系を導入することにより、従来の光学系では実現できなかった共焦点顕微鏡が開発された。
図2に共焦点蛍光顕微鏡の構成を示す。共焦点蛍光顕微鏡の構成は、図1のレーザー走査型蛍光顕微鏡の構成とほとんど同じであるが、検出器の直前にピンホールを配置することが大きな特徴である。ピンホールはレーザーの集光位置と共役な位置に配置する。このピンホールによって、試料のディフォーカスした位置からの蛍光を除去することができるため、分解能が向上するとともに、試料の3次元構造を観察することが可能となる5)。また、レーザー走査顕微鏡では強度の大きなレーザー光を一点に集光するため、フォーカス位置に非常に強度の大きなスポットを形成し、容易に非線形光学効果を利用したり、試料に刺激を与えたり加工したりすることが可能となった。
現在、光学顕微鏡において全く新しい展開が起こりつつある。単なる光学部品や光源などの性能向上にとどまらず、全く新しい原理に基づく、分解能向上への挑戦が始まっている。新規な蛍光プローブの開発により光制御機能を持たせたり、マルチカラー化したり、蛍光の飽和励起や誘導放出などを積極的に利用する方法が開発されている。また、電子線で微小な光源を励起したり、光で超音波を励起するなど、光以外の物理も取り込むことによって、従来の光学顕微鏡を超えた新しい光学顕微鏡が開発され、分解能が飛躍的に向上している。
例えば、PALM(photoactivation localization microscopy)6)またはSTORM (stochastic optical reconstruction microscopy)7)と呼ばれる顕微鏡では、光制御可能な蛍光プローブを用いて、分解能を飛躍的に向上させている。また、SAX(saturated excitation)顕微鏡では蛍光の飽和励起を積極的に使用している8,9) 。STED(stimulated emission depletion) 顕微鏡では蛍光の誘導放出により、集光スポットを等価的に小さくすることに成功している10)。図3にSTED顕微鏡の原理を示す。STED顕微鏡では、試料に励起光照射し、蛍光分子を励起する。これは通常の蛍光顕微鏡と全く同じプロセスである。超解像を実現するためにSTED顕微鏡では、励起光を照射した直後にドーナツ状の強度分布をもつSTED光を照射する。STED光が照射された領域の蛍光分子は、STED光により誘導放出が誘起され、STED光と同じ波長の光を放出する。したがって、励起光により励起された蛍光分子のうち、中心付近に存在しSTED光が照射されなかったものは、通常の蛍光寿命で蛍光分子の波長拡がりを持つ光を放出して緩和する。STED光以外の波長の蛍光を検出することにより、選択的に励起スポットの中心部分のみを観察することができ、高分解能を実現可能である。
現在、我々が開発を進めている電子線励起アシスト(EXA: electron excitation assisted)光学顕微鏡では、生物試料観察における光学顕微鏡の優位性と電子顕微鏡における高分解能性を融合した新しい光学顕微鏡である。従来の光学顕微鏡に比べて十分高い分解能を実現することが特徴である。
３．EXA顕微鏡の原理と特徴
図4に、我々が開発したEXA顕微鏡の原理を示す。本顕微鏡では、集束電子線により蛍光膜上に微小な点光源を励起する。蛍光薄膜上に試料を直接配置し、蛍光膜上の微小光源により試料を照明する。試料と蛍光薄膜の距離が十分小さい場合、電子線励起によって生じた微小蛍光光源のエバネッセント波で試料を観察することができ、回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。電子線を走査することにより、蛍光発光の領域を走査し、画像を取得する。
本システムでは、電子線によって微小な輝点を実現するため、観察系は通常のレーザー走査型光学顕微鏡と同様の結像システムとなる。したがって、既にこれまでに開発されてきた光学顕微鏡の光学系を検出システムに応用することによって、高い空間分解能と多くの機能を持つ検出システムを構築することが可能である。
また試料を配置する蛍光薄膜の部分で光学顕微鏡部と電子顕微鏡部が分離されるため、試料を配置する部分には真空や金属膜の蒸着などは全く必要なく、通常の光学顕微鏡と同様の環境で使用することが可能である。
本手法は次のような利点を有する。
1) ナノメートルオーダーの分解能を実現可能
電子線ビームを集光して蛍光薄膜を励起するため、光の回折限界によらない微小な点光源を実現することが可能である。そのため従来の光学顕微鏡の分解能を大きく超えた分解能を実現することが可能となる。
2) 生物試料の光学定数(吸収、屈折率分布)などで決まる光強度分布を観察可能
光学顕微鏡結像部分で検出されるのは、微小光源から試料を透過した光、または微小光源によって励起された蛍光強度分布である。したがって開発する顕微鏡システムでは、試料の光学定数分布を測定することが可能である。これは、X線による透過画像や電子顕微鏡による観察像、原子間力顕微鏡で試料の凹凸を観察するのとは、全く観察対象が異なる。
3) 電子線を走査するため高速な観察が可能
電子線を走査することにより、容易に微小光源を走査することができ、高速な観察が可能である。
4) 蛍光薄膜材料の選択による高機能化
いろいろな機能を持つ蛍光薄膜（発光波長特性、偏光特性、非線形光学応答など）を用いることによって、さまざまな機能を持つ光ナノイメージング手法を実現することが可能である。
４．EXA顕微鏡の開発
EXA顕微鏡では、電子線を伝搬させるための真空と試料を配置するための大気圧の環境を極薄の窒化シリコンを用いて分離した。窒化シリコンは、機械的強度が非常に強く、耐薬品性も優れている。そのため、非常に薄くしても、気圧に耐え、SEM鏡筒の真空を維持することができる。図５にEXA顕微鏡で用いた窒化シリコンを示す。膜厚は50 nm である。ウィンドウ部のサイズは、100 x 100 μm である。
EXA顕微鏡の空間分解能の評価をするため、窒化シリコン薄膜中での電子線の散乱をモンテカルロシミュレーションにより求めた。薄膜中での散乱は、EXA顕微鏡の空間分解能を決める重要なファクターである。図６に窒化シリコン薄膜中での電子線の散乱のシミュレーション結果を示す。窒化シリコン薄膜の厚さは、30, 50, 75 nm である。入射電子線の加速電圧は、1, 5, 10 kV である。電子線は、直径2nm のスポットサイズで薄膜上部に収束させた。この結果より、入射電子の加速電圧が高く、窒化シリコン薄膜の厚さが薄い場合に電子線の散乱が小さいことが分かる。加速電圧10kV、窒化シリコン膜厚50 nm の場合、電子線の散乱は薄膜裏面で12nm 幅である。この結果より、窒化シリコン薄膜中を用いることで、光の回折限界よりも小さいスポットを実現できることが分かる。
窒化シリコン薄膜を用いることで、電子線の散乱により光源を大きくすること無く、試料を大気圧下に設置することが可能となる。これにより、液中や様々なガス雰囲気中での試料観察が実現する。また、窒化シリコンに生体適合性のコーティングを行うことで、様々な細胞を培養することも可能である。
図７に分解能評価の基礎実験として、直径50nm のラテックスを観察した結果を示す。蛍光膜上に直接ラテックスを配置し、電子線で蛍光を励起した。図７(a)は検出した蛍光による観察画像、(b)は白線部分の強度プロファイルである。図７(a)の白線上に存在する4つ粒子がそれぞれ分離して観察されており、その強度分布も50 nm の半値幅となっている。この結果より本顕微鏡システムは50 nm 以下の分解能を有することが確認できる。
５．D-EXA顕微鏡の開発
我々は、EXA顕微鏡のもう一つの形態として、ラベリングした生物細胞を電子線で直接励起する高分解能顕微鏡(D-EXA: Direct electron beamexcitation assisted)の開発も進めている。図８にD-EXA顕微鏡の原理を示す。この顕微鏡では、大気圧と真空を分離する薄膜を、集光電子線を透過させ生物試料に直接照射し、ラベリングした蛍光分子を直接励起する。通常のレーザー走査蛍光顕微鏡において、レーザーで蛍光を励起する代わりに、透過電子線で励起する方法である。レーザーに比べて電子線は集光性が高いため、光の回折限界を超えた分解能を実現することが可能となる。この手法の利点は、(a)微小光源を実現するための蛍光膜が不要であること、(b)生物・医学分野でこれまで開発されてきた様々なラベリング手法が有効活用できること、(c)試料の自家蛍光を励起すればラベルフリーの観察が可能なことなどである。一方、生物試料に直接電子線を照射するためダメージが大きいこと、試料の深いところを観察すると電子線散乱により分解能が低下することなどが問題となる。
図9(a)にD-EXA顕微鏡により取得したチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO)の観察結果を示す。この試料は染色等の処理は行なっておらず、取得された蛍光は試料の自家蛍光によるものである。細胞内に存在する顆粒が高分解能かつ高コントラスで観察できていることがわかる。図9(b)には比較のための通常の位相差顕微鏡で取得した観察結果を示す。図9(b)は図9(a)と同じ場所を観察したものである。
６．まとめ
光学顕微鏡は、光学部品およびレーザー光源の高品質・高機能化による進展だけではなく、全く新しい原理に基づく高分解能化、高機能化が進められている。材料科学、電子線、超音波、プラズモン光学、画像処理、など様々な技術を組み合わせることにより、「光学顕微鏡の再発明」が進められている。
我々が開発を進めているEXA顕微鏡システムは、生物に優しい光学顕微鏡の特徴と非常に高い分解能を持つ電子顕微鏡のそれぞれの利点を融合した新しいイメージング手法である。収束電子線を蛍光体に照射し、光の回折限界より小さいナノ光源を生成する。光を利用するため、試料の屈性率、吸収係数、偏光特性の情報を取得することができる。また、蛍光薄膜を高機能化することで、試料の様々な光学情報を取得することが可能となる。紫外線により、細胞などの蛍光イメージングができる。また、白色光を発光させれば、分光特性を測ることができる。また、ドットアレイやナノホールアレイ11)構造を蛍光薄膜中に作製することにより、電子線の散乱を押さえ、より高い空間分解能が得られる。検出系は、光学顕微鏡を用いているため、これまでに開発されてきた光学顕微鏡の光学系を検出システムに応用することができる。高い空間分解能と多くの機能を持つ検出システムを構築することができる。
このような特徴を有するEXA顕微鏡により、これまで観察できなかった微小な領域の生命現象を明らかにすることが可能となり、ナノ・バイオテクノロジーに大きく寄与するものと考える。分光器、高速な検出器などとの組み合わせによる分光計測による定性分析、高速現象の時間分解計測を導入することで、医学・生物分野のみならず、電子工学分野、化学分野、製薬分野への応用展開も期待できる。