1.はじめに
現在、バイオアッセイとして免疫アッセイやDNAバインディングアッセイなどが医療診断、食品・環境検査、ならびに基礎生命・化学分野において広く用いられている。 これらのアッセイ法のほとんどは、表面プラズモン、エライザ、DNAチップといった固体・液体界面での反応を利用した手法である。 これらの測定法は、検出対象が拡散によって界面まで到達するのを待たねばならず、検査に長い時間を要する。 さらに、抗体やオリゴヌクレオチドの固定化や洗浄作業を必要とするヘテロジニアスな測定であるため、これもまた時間と労力を費やす。 そこでこれらの問題点を解決するため、バルク溶液中での高感度なホモジニアスアッセイ法が強く求められている。 特に医療現場では現在数10分を要する診断時間を数分まで短縮することが望まれている。
以上のように、従来のバイオアッセイの感度を維持しつつ、計測時間の短縮、作業量の低減が喫緊の課題となっている。 しかし、現在の研究の潮流は高感度化のみを追求した研究がほとんどであり、固体・液体界面を利用したヘテロジニアスな検出法が抱える現実的な問題の解決に向けた取り組みはほとんどなされていない。
このような背景のもと、本研究では、金ナノ粒子を用いたバルク溶液中でのホモジニアスなアッセイ法として、検体となるターゲットDNAと相補的なDNAを固定化した金ナノ粒子を用意し、ターゲットDNAの存在によって結合した金ナノ粒子1つ1つを高感度に検出・識別する手法を提案する。 単体の球形粒子とそれら2つが結合した二量体では、その光学的偏光特性と回転拡散運動特性が大きく異なることに着目し、偏光顕微計測下でそれらを精度良く識別することを目指した。
2.孤立金ナノ粒子とその二量体の識別法
金ナノ粒子は光学的にはその散乱断面積が大きく、化学的に安定かつ修飾が容易であるため、検出対象への明るい標識として、バイオセンシングやバイオイメージング分野で広く利用されている1)。 この特徴を活かしたDNAアッセイ法や抗原抗体アッセイ法が数多く提案されており、インフルエンザ診断や妊娠検査などにおいて既に実用化されている。 金ナノ粒子を用いたホモジニアスアッセイ法としては、検体・ターゲット分子を介したコロイド粒子の凝集にともなう色変化を観察する方法が考案されている(図1(a))2・3)。 この手法は、目視で検体の有無の判定ができるという利点があるものの、計測可能な色変化を誘起するためにはそれ相当の検体濃度が必要であり、高い検出感度は期待できない。 ガン診断などへの応用を想定すると、検体濃度は非常に低く、ほとんどが単体の金ナノ粒子の中で、ごくまれに二量体が存在するという状況となる(図1(b))。 このようにごく少数の二量体の存在、あるいは定量的にその割合を評価するにあたり、もはやアナログ的にプラズモン共鳴のピークシフトを計測するのは困難である。 そこで本研究では、光学顕微鏡下で水中をブラウン運動する金ナノ粒子1つ1つに対して、それが単体粒子なのか二量体なのかを識別し、デジタルに計数する方法を提案し、それを実証する。
単体粒子と二量体を識別する上でそれらの散乱光強度だけを信号として検出する場合、以下の2点にまず着目することになる。
(1)二量体の散乱光強度は単体のそれの約4倍である。
(II)二量体の並進運動の拡散係数は単体のそれの約1/2である(二量体の信号持続時間は単体のそれの約2倍である)。
ただし、本手法では顕微鏡の観察領域をブラウン運動で通過する粒子を検出するため、散乱光強度や信号持続時間は個々の粒子の運動の軌跡に大きく依存する。 すなわち識別の指標としては、これらだけでは不十分である。 そこでここでは、次の(3)にも着目する。
(III)二量体は単体よりもはるかに大きな光学異方性を有する。
二量体を楕円体で近似すると、その長軸方向と短軸方向で大きく異なる電気感受率を持ち(プラズモン共鳴波長が異なる)、これが異方性の起源となる。 散乱光の強度だけでなく、その偏光状態を計測することにより、異方性の有無を判定できる4,5)。 これを指標とすれば、きわめて容易に識別可能と見えるが、実際には以下の問題が生ずる。 単体粒子の形状は決して真球ではなく、多少なりとも歪んでいるため、異方性を有する。 さらに二量体はその粒子問に検体の大きさ程度の空隙があり、これが異方性を低下させる原因となる。 すなわち、両者の異方性の差は期待したほど大きくない。 そこで、さらに以下も考慮する。
(IV)二量体の回転拡散係数は単体のそれの約1/4である。 粒子の回転拡散にともない、上記異方性のともなう偏光信号が時間的に変化する。 この時間トレース信号に対して自己相関解析を行うことにより、回転拡散運動の時定数を評価し、識別の指標とする。
3.実験方法
測定に用いる金ナノ粒子二量体の作製方法についてまず述べる。 金ナノ粒子は田中貴金属製金コロイド溶液を使用した(直径40nm、濃度170pM)。 一連の作業の流れを図2に示す。
(i)BSPP溶液を添加することにより、金ナノ粒子表面を負に帯電させ、粒子の分散性を高める。
(ii)金ナノ粒子コロイド溶液を2つに分け、一方の溶液には、以降「フロント側」と呼ぶDNA(5'-AAACACTCCATCAGCGATGTAACCATG-3'、長さ約9nm)、もう一方の溶液にはこれと相補的な関係にある「リバース側」のDNAをそれぞれ加え、固定化する。 DNAの濃度は金ナノ粒子1個あたり、約30本のDNAで修飾されるよう調整した。
(iii)ハイブリダイゼーションを容易にするために表面をSAM修飾し、DNAを金ナノ粒子表面に対して正立させる。
(iv)2つの溶液を混合し、インキュベートにより、フロント側DNAとリバース側DNAをハイブリダイゼーションさせ、二量体を形成する。
所望の二量体が作製できていることを確認するために、電気泳動解析を行った。 図3(a)に電気泳動後のゲルの写真を示す。 明瞭なバンド構造が見えており、下から3番目までのバンドについて、そこに含まれている粒子を取り出し、透過電子顕微鏡で観察した結果が図3(b)一(d)である。 それぞれ単体粒子、二量体、三量体であることがわかり、計数によって二量体の比率が約80%であることが確認された。
単一粒子からの散乱光の偏光回転を計測するための実験配置を図4に示す。 光源としては波長660nmの半導体レーザを使用し、対物レンズ(開口数0.85)で試料溶液内に集光する。 ブラウン運動をする粒子が観察領域を通過する際に発する散乱光を対物レンズで再び集光する。 対物レンズで集光される光信号には、試料基板からの反射光や観察領域近傍に存在する粒子からの散乱光などが混在しているため、これらを除去するために、ピンホールを使用する。 ピンホール通過後、散乱光信号を直交する2つの偏光成分に分離し、それぞれの強度をフォトダイオードで検出する(以下それぞれの信号強度をIX、lyと表記する)。
4.実験結果と考察
単体、二量体が観察領域を通過した際の典型的な信号を図5に示す。 単体粒子の場合、ブラウン運動により信号強度が時間的に揺らぐが、異方性が小さいため、Ixとlyの差は常に小さな値にとどまっている。 Ix-lyの時間トレースを見ると、ほぼ雑音レベルであることがわかる。 一方、二量体の場合、異方性が大きいため、粒子の回転にともなって、Ixとlyに大きな差があり、その大小関係が頻繁に入れ替わっている。 Ix-IYも雑音レベル以上に大きく変化している。 ただし、単体粒子でも、形状に多少の歪がある場合、Ix-IYは大きな変化を示し、二量体の識別が困難な場合もある。 これらを精度良く識別するためには、回転拡散運動の違いに着目するのが有効である。
時間トレースから回転拡散の情報を抽出するために、ここでは自己相関関数を計算し、その減衰の違いを指標とすることにした。 同時に自己相関解析により、雑音成分を除去した信号強度を評価することができる。 図5の時間トレースから自己相関関数F(t)を計算した結果が図6である。 どちらも時間遅延二〇での値一F(0)で規格化してある。 雑音はデータ取得時間間隔dTよりも短い時間スケールで変化しているので、-F(d7)の値が雑音を除去した信号積分強度と解釈できる。 単体の場合、雑音成分が主であるため、F(47)の値がF(0)に対して大きく減少している。 またその後の信号の減衰も非常に速い(回転拡散が速いほど減衰も速い)。 一方、二量体の場合、異方性の大きさに応じたF(47)の値を取り、さらにその後の減衰も緩やかである。 したがって、異方性の大きさと回転拡散の違いをともに反映し、単体と二量体に大きなコントラストを与える指標として、適当な遅延時間後のF(t)に着目した。 ここでは具体的にはF(30?s)(≡d)を採用した。
単体のみを含む水溶液(フロント側DNAを固定化した金ナノ粒子コロイド溶液)、ならびに上記の手順で作製した二量体溶液(単体、三量体も含む)を試料とし、それぞれ1,000個の単体、二量体に対して測定をおこなった結果をまとめたものが図7である。 dの値のヒストグラムとなっており、単体溶液と二量体溶液で分布に明瞭な違いが確認できる。 大きなdは二量体に起因すると考えられる。 例えば、d>0.45となった粒子の数は二量体溶液では約400個、単体溶液では4個であった。 今回使用した単体溶液中の金ナノ粒子を透過電子顕微鏡観察したところ、約1%の粒子については、二量体になっていた(これはハイブリダイゼーションではなく、単にDNAがからまって形成されたものと考えられる)。 この点を考慮すると、∠>0.45となる粒子はほぼ誤りなく、二量体であると判定できる。 実際には安全性を見て、もう少し小さな∠をしきい値として設定することになる。 二量体と判断する∠のしきい値が、測定時間を決定する(Dのしきい値が大きいほど、測定に要する時間は短くなる)。
最後に、この手法の検出限界について考察する。 フロント側DNAが固定化された単体金ナノ粒子溶液(濃度[F])に、検体としてリバース側DNAを固定化した単体金ナノ粒子溶液(濃度[R])を添加することを想定する。 フロント側DNAとリバース側DNAの解離定数をKとすると、混合溶液中の二量体濃度は[F][R]/([F]+K)となる。 一方、先に述べたように、フロント側溶液には一定の割合で、意図しない二量体や極めて歪な単体粒子が混在している。 その比率をβとすると、混合溶液中におけるそのような粒子の濃度はβ[F]となる。 ハイブリダイゼーションによる二量体を正しく検出するためには検㈲農度が[F][R]/([F]+K)〉β[F]、すなわち[R]〉β([F]+K)を満たす必要がある。 例えば本実験では[F]-170pM(Kはこれよりも小さいとする)、β=0.01なので、[R]>1.7pMであれば、検出可能となる。 [F]とKの大小関係にも依存するが、[F]>Kである限りは、検出限界濃度はβ[F]となる。
5.まとめと展望
本研究では、金ナノ粒子を用いたサンドイッチアッセイ法の高感度化を目指し、圧倒的多数の単体粒子の中からごく少数の二量体を見つけ出す手法を開発した。 特に二量体がもつ光学的異方性と回転拡散の特性を利用し、1つ1つの粒子を順次観察しながら、それらが単体、二量体のいずれであるかを高精度に識別することを可能とした。
今後さらに精度を向上させ、測定時間の短縮に結びつけるためには、単体と二量体の信号強度(∠値)に一層のコントラストを与える必要がある。 本研究では照明光として波長660nmの赤色のレーザを使用したが、よりプラズモン共鳴に近い波長550～650nmの光源を用いることによって、より識別が容易になる可能性がある。 また感度に関しては、検査液(フロント側DNA溶液)の低濃度化とその中に意図せず形成された二量体濃度の低減が基本的な指針となる。 ただし前者は測定時間の増大につながるため、後者に注力すべきであると考えている。