1.はじめに
細胞の中では、多くの生体分子が相互作用して生命機能を発現している。近年の光学顕微鏡技術の発展にともなって、1個の生体分子の動きをナノメートルの精度で検出すること、1個の蛍光分子をリアルタイムで観察することなどが実現している1)・2)。これら1分子レベルで分子の機能を計測・観察する技術は、集団を観察することで得られる平均化された従来の情報と比較して、より直接的に個々の分子の動き・振る舞いについての情報を得ることができる。特に、細胞運動や細胞内小胞輸送に関わる生体分子モーターは化学エネルギーを力学運動に変換するのが主たる機能であるため、その動作メカニズムの理解は1分子計測技術の発展とともに深まっている3)。従来の生体分子モーターの研究では、細胞から抽出された分子を顕微鏡の試料ステージに固定して観察するin vitro再構成系が主流であった。近年、緑色蛍光タンパク質(GFP)、量子ドット、金コロイド粒子などで標識した分子モーターの動きを、細胞内においてナノメートルの位置精度で追跡する研究が報告されている4)。細胞内で機能している分子を高精度に可視化する技術の開発は、細胞膜を介したエネルギー変換・情報伝達などのin vitro再構成が困難な系についても1分子計測技術を適用ができるため応用できる範囲は非常に広い。また、細胞は三次元空間が広がっており、分子のダイナミックな動態を明らかにするためには、顕微鏡の光軸方向の動きも追跡できると新たな情報を得られる可能性が広がる。そこで本研究では、細胞内で機能する分子モーターの三次元追跡を実現する顕微鏡の構築を目的とした。
2.方法
細胞内で機能している生体分子の動きを高精度かつ高速に追跡するためには、標的となる分子から多くのシグナルを取得し、背景となるノイズを減らすことが必要である。細胞生物学分野においては、蛍光色素や蛍光タンパク質によって生体分子を標識して観察する手法がよく用いられる。しかしながら、蛍光観察では非常に高いシグナルノイズ比を実現できるものの、蛍光は一般的に微弱であること、槌色があることなどの理由から取得できるフォトン数が制限されてしまうため、高精度計測と高速計測を同時に実現することは非常に困難である。本研究では、金コロイド粒子によって生体分子を標識し、粒子からの散乱光を観察する方法を採用した。金コロイド粒子からの散乱光により期待されるシグナルは非常に大きく、槌色の心配がないため、高い時間分解能で長時間の観察が可能である5)。一方、散乱光を指標とする観察では、蛍光観察のような照射に利用する光の波長と観察に利用する光の波長の違いを利用したシグナルの分離ができない。そこで本研究では、細胞からの散乱光をできる限り低く抑えるために後方散乱のみを取得する暗視野光学系を採用した。照明光の波長と比較して大きいマイクロメートル程度の大きさである細胞からは前方散乱が占める割合が大きいが、照明光の波長よりも十分小さい金コロイド粒子からは等方的に散乱することが知られている。つまり、後方散乱のみを取得することによって、高いシグナルノイズ比で金コロイド標識された生体分子の動きの計測を実現することが可能になる6)。また、顕微鏡上の物体を三次元的に追跡するために、顕微鏡の光軸上の異なる面の像を1つのカメラで同時に取得し、その像の差分からZ軸方向への動きを追跡する手法を採用した7),8)。本研究では、高精度計測と二焦点光学系を融合することで、生物試料の高速三次元追跡を可能にする顕微鏡を構築することを試みた。
3.装置の概要
図1に構築した計測装置の概略および写真を示す。防振台上に設置したオリンパス社製の倒立型光学顕微鏡をべ一スにして、後方散乱型レーザー暗視野照明系と高速度カメラへの結像系に二焦点光学系を組み込んだ。後方散乱型レーザー暗視野光学系では、HeNeレーザー(波長632.8nm、メレスグリオ社)から出射した光をミラー群、NDフィルタ、λ/4波長板、対物レンズの後焦点面に集光するように配置したレンズ群を通過させた後、φ1mmの小型45度ロッドミラーで反射させて高開口数の対物レンズ(オリンパス社)へと導入した。小型45度ロッドミラーは対物レンズの直下に配置し、位置調整を容易にできるように小型XYステージに固定している(図1、写真)。対物レンズから出射する平行光によって試料は照射される。試料はXYZピエゾステージに保持されており、ナノメートル精度で位置制御を行うことができる。試料からの散乱光のうち後方へと向かう光は、照射に使用した対物レンズによって集められる。なお、試料以外からの光(カバーガラス表面での反射光など)は、小型45度ロッドミラーによりブロックされて、レーザー入射の方向に戻る。試料からの散乱光は顕微鏡本体の結像系を通過した後、二焦点結像光学系に導入される。試料面と共役な位置に配置した矩形型スリットを通過させることで観察領域を制限した後に、レンズを通して平行光となる。この平行光はハーフプリズムによって二光路に分岐し(Pathl、Path2)、それぞれの光路上に配置されたレンズ(L1、L2)を通して高速度CCDカメラ(IMPERX社製)の受光面に投影した。L1、L2は同じ焦点距離をもつレンズであるが、L1はCCD受光面から焦点距離の位置に配置しているのに対して、L2についてはCCD受光面からの位置は焦点距離からわずかにずらしている。この光学系によって顕微鏡試料上の異なる二焦点の像を同時に取得することができ、Path1を通過した像が顕微鏡の試料上にピントが合うときには、Path2を通過した像はわずかにデフォーカスした像が投影されることになる(図2)。高速度カメラに投影された像は、取り込みボードを経由してPCに収録した。Focus1およびFocus2に対応する像は、LabVIEW(ナショナルインスツルメンツ社)で作成したプログラムによって重心解析・輝度解析などの処理をオフラインでおこなった。
4.実験結果
4.1装置の校正
装置の校正には顕微鏡のカバーガラスに結合させた直径100nmの金コロイド粒子(BBInternational)を用いた。まず、X軸、Y軸方向については、(1)格子状のマイクロメーターにより1ピクセルに対応する距離を校正する方法、(2)ピエゾステージにより金コロイド粒子をX軸、Y軸方向に駆動し、その位置をサブピクセル精度で重心解析して校正する方法9)、という2っの独立な校正方法が誤差2%以内で一致することを確認した。Z軸方向(顕微鏡の光軸方向)については、ピエゾステージによって試料を上下方向に一定の速度で駆動し、二焦点における金コロイド粒子の画像の違いから見積もった(図3(a)、(b))。二焦点における金コロイド粒子中心部の散乱強度の差分と実際にピエゾステージを移動させた距離との関係を図3(c)に示す。今回の装置の設定条件では、Z軸方向に800nmにわたって良い線形性を得ることができた。次に、装置の安定性について検証した。図4(a)一(c)には今回使用した高速度カメラの設定値の上限である0.6ミリ秒のフレームレートで取得した固定した金コロイド粒子の各軸の変位を、図4(b)一(f)には0.5秒間のパワースペクトル密度を5トレース分平均したグラフを示す。レーザーのパワー密度が約80nW/μm2の条件で、各軸の変位の2乗平均はX軸、Y軸、Z軸に対してそれぞれ0.7nm、0.7nm、1.3nmであった。図4(g)は各軸をピエゾステージによって10nm駆動させた時の計測結果を示した。以上の測定から、本研究で構築した計測装置を用いることで、サブミリ秒の時間分解能でナノメートル精度の三次元計測が可能であることが確認できた。
4.2生物試料への応用
本研究では、バクテリアがもつ生物回転ナノマシン:べん毛モーターの計測に今回構築したシステムを応用した。バクテリアのべん毛モーターは、多数の分子が自己集合して構築される直径が約50nmの生体超分子であり、膜を通過するイオンの流れを回転力へと変換する分子モーターである(図5(a))。その高速回転(1秒間に100回転以上)、スイッチング機構などの特徴は、人工ナノマシンを設計する上でお手本となる存在である10)・11)。バクテリアは、このモーターに連結している細胞外に突き出た螺旋状のフィラメントを回転させて水中を自由に遊泳することができる。モーターの回転機能の解明には詳細な回転計測が必要であるが、他の分子モーターのようにin vitro再構成することができないため細胞内での計測が必須であること、その回転速度が高速であるため回転計測が困難であること、などの理由から回転メカニズム解明はあまり進んでいない。今回我々は、細胞外に突き出たフィラメントに直径100nmの金コロイド粒子を結合させ、その動きを追跡することにした(図5(b))。図5(c)に回転する金コロイド粒子の二焦点の連続像を示している。一連の画像から、金コロイド粒子の位置および散乱強度が周期的に変動していることがわかる。図5(d)、(e)はそれぞれ、Focus1の画像のみを利用した重心解析、Focus1とFocus2の画像から三次元再構築した結果を示す。この実験例ではビーズは主にY-Z面で回転しており、従来の二次元追跡(図5(c)に相当)では、回転周期などの情報は得られるものの、モーターの分子メカニズムを考察する上で重要になる回転角度のデータを得るためには補正が必要である。一方、三次元追跡ではビーズの回転をクリアに観察することができていることを確認できた(図5(e))。最近、我々はこのモーターが小さな回転ステップ(～14°)を繰り返して回転する、つまり、1回転あたりの26回の素過程が存在することを報告した12)。この26という数字はモーター回転子の構造周期と一致する興味深いものであったが、計測で得られた回転ステップ分布のばらつきが大きかった。この幅広い回転ステップサイズの分布は、モーターの回転メカニズムにとって本質的なものか、それとも得られた二次元データを楕円近似補正したため誤差が大きくなったものかは現在のところ明らかではない。今後は本研究で開発した装置を利用することで、補正によるデータの歪みを最小限にした計測をおこない、より詳細にモーター回転機構の解析を進めることができるのではないかと期待している。
5.まとめ
本研究では、細胞上で機能する生体分子を金コロイド粒子で標識し、その動きを三次元的に追跡する装置を構築した。この装置によって、X軸、Y軸方向で0.7nm、Z軸方向で1.3nmの位置精度、0.6msの時間分解能での計測を実現することができた。この位置精度は、例えば、神経細胞内の軸索輸送に関わる分子モーターであるキネシンが微小管上を8nmの微小なステップを繰り返して動く様子を十分に検出できると期待される13)。また、装置の時間分解能の制限は高速度カメラのフレームレートによるものであり、より高速な画像取り込みが可能であるカメラに置き換えることで、システムをさらなる高速化へ改善することが可能である。高速フレームでの計測では1フレームあたりに取得できるフォトン数が問題になるが、散乱光を用いた実験系では槌色などの心配もないため、照明用レーザーの光強度をあげて10倍程度の改善は容易に実現可能である。なお、現在利用している照明用のレーザー強度は通常の蛍光観察と比較しても強くはないため、細胞へのダメージについても影響は小さいと期待できる。生体分子の機能・動きを1分子レベルで解析する手法は”in vitro"において発展してきたが、今後は"in vivo"における解析へと発展すると期待される。本研究では、構築した高速三次元ナノメートル計測系を細胞内で機能する生物回転ナノマシン:べん毛モーターの機能解析に応用し、その有用性を確認した。もちろん本システムは、べん毛モーターの解析に特化されたものではなく、エンドサイトーシスを利用して金コロイド粒子を細胞内に取り込ませることができれば、キネシン・ダイニンが細胞内の微小管ネットワーク上を移動する様子のイメージング、DNA結合タンパク質の細胞内追跡による転写機構のイメージングなどの興味深いあらゆる生命現象にも応用可能である。さらに、構築した装置は通常の倒立型光学顕微鏡に組み込んでおり、対物レンズの反対側に当たる空間には何も装置を組み込む必要がない。っまり、パッチクランプやプローブ顕微鏡など他の技術との共存が比較的容易であり、今後新しい計測系との融合も期待することができる。