1.はじめに
生体分子の特異的な相互作用、例えば、抗原一抗体、核酸塩基対、ホルモンーレセプター、タンパク質一核酸、などは、生命現象と密接な関係にあるので、この特異的相互作用を検出できる装置は、生命科学分野の研究においては不可欠である。表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、生体分子の特異的な相互作用を非標識実時間での検出、および相互作用における「動的パラメータ」を評価できることが大きな特徴であり1)2)、既に数社のメーカーによって製品化されている3)。
表面プラズモン共鳴は、金属薄膜の表面において極めて特異的な角度で光が入射したときに起こる現象である。この共鳴角は金属薄膜近傍の媒質の屈折率に極めて敏感なので、相互作用をこの範囲に起こさせると媒質の屈折率が変化し、結果として共鳴角が変化する。これによって相互作用を測定することができる。表面プラズモン共鳴の起きるエバネッセント波の領域は金属表面の極近傍(300nm以下)であるので、この範囲内に相互作用を起こす必要がある。そのため、金属表面への生体分子を固定化する様々な方法が開発されている。特に多く利用されているのは、カルポキシメチルデキストラン膜である4)。我々の研究グループでは、プラズマ重合膜を利用して金属表面への生体分子の固定化を報告している5)。プラズマ重合膜はこのコーティング固定化膜として有用である。金属表面に均質に極めて薄く形成されるだけでなく、膜表面にはアミノ基のような官能基が存在し、膜表面がフラットでピンホールフリーのために生体分子を2次元的に高密度に固定化することができる。また、表面プラズモン共鳴を起こさせるのに必須の金属薄膜(約50nm)もスパッタリングのようなドライプロセスで形成されるので、製造プロセスが有利である。
金属には、金が多く使用されている。しかし、物性上(複素誘電率)は金よりも銀の方が感度の点では有効である。それにもかかわらず金が使用されているのは、金の方が表面に酸化膜ができにくいこと、チオール結合6)を利用できること、などが上げられる。プラズマ重合膜は、どのような金属薄膜にも形成可能であり、銀表面の抗酸化コーティングとして有効であると考えられる5)。
以上の背景から、本論文では、表面プラズモン共鳴の理論解析により、金属コーティング膜の膜厚と屈折率がセンサー特性に及ぼす影響について調べた。図1(a)は、表面プラズモン共鳴の基本的な構造である。図1(b)は、本研究の目指すセンサーチップである。金属薄膜上にコーティング層が形成されている。その厚さは、エバネッセント領域以下(100nm以下)である。
2.理論と解析方法
表面プラズモン共鳴を発生させるためには、電子を集団的に励起させればよいので、光(電磁波)を金属表面に入射すればよい。しかし、光をそのまま金属表面に入射しても、表面プラズモンは共鳴を起こさない。これは、波の進む速度とプラズマ波の進む速度が異なるためである。表面プラズモンの進行速度は光速より必ず小さい。すなわち、同じ振動数に対して、表面プラズモンの波数は光波の波数より常に大きい。光により表面プラズモンを共鳴させるためには、普通に伝播する光よりも遅い速度で走る光が必要となり、このような光は通常の光の伝播条件を満たさない状況に光を導入することにより発生させることが出来る。つまり、光の全反射によりそれが可能となるのである。光の全反射では、その境界面から離れるにしたがって振幅が減衰する表面電場(エバネッセント場)が発生する。このエバネッセント場は境界面に沿った方向の進行速度が普通の伝播光より遅い。したがって、この波を用いれば、表面プラズモンを共鳴させることが出来るのである。この方法は全反射減衰法(ATR:AttenuatedTotalReflection)と呼ばれる。
本解析では、図1に示すようなKretchmann配置を採用する。このKretchmann配置において入射角を変えていくとある入射角θ,(共鳴角)で入射光と表面プラズモンのカップリングが起こり、表面プラズモン共鳴に起因する強い吸収が生じる。プラズモンは金属表面ではそれに接する媒質によってその進行速度を制限される。表面プラズモンの分散の変化は共鳴角の変化へとつながる。すなわちこの共鳴角を測定することによって試料を判定するというセンサーとして利用できるのである。また、この性質は界面の(測定面の)変化に対して高い感度を有し、かつ即時性も有しているので表面上での物質の反応や濃度の検出を高感度かつ実時間測定可能なバイオセンサーとなる1)7)。
まず、基本構造である金属薄膜だけのとき(図1(a))を考える。プリズム/金属薄膜/測定試料の構造では、金属薄膜と試料の界面を伝搬する表面プラズモンの波数鷹p(∂の分散関係は次式で表すことができる。
ここでemは金属薄膜の誘電率(金属としてAg,Au,Al,Cuが用いられる)、ε、は試料の誘電率、ωは角速度、Cは光速度である。P偏光した光を屈折率の大きいプリズム側から屈折率の小さい金属側に臨界角以上で入射すると光はその界面で全反射される。しかしこのとき界面から、深さ方向に対し指数関数的に減衰する電磁波(エバネッセント波)が出る。このエバネッセント波の界面に平行な波数成分は
ここでθは光の入射角,npはプリズムの屈折率(誘電率εp=npa)であり,κ、p(ω)が表面プラズモンの波数と等しくなったとき、金属薄膜/試料界面で表面プラズモン共鳴がおきる。これを踏まえ、金属コーティング層があるとき(図1(b))を考える。金属薄膜上に誘電率ε,のコーティングが形成されているとする。したがって境界条件が変わるため、それに従い表面プラズモンの波数も変化する。その波数の変化分Dκ,p(cu)は次の式で与えられる。
ここでκo(ω)=cu/cは真空中の光の波数,dは誘電体(金属コーティング膜)の膜厚である。またこの場合の表面プラズモン共鳴条件は次のようになり
金属薄膜上に形成された膜の誘電率と厚さによって、表面プラズモンの波数が変化し、共鳴角もそれに伴って変化することがわかる。また、この式(4)を解くことにより理論的に表面プラズモン共鳴角θ,を求めることができる。
角度掃引による反射率曲線の理論解析を行う。ここでは、理論で示したのと異なり光吸収型での解析を示す。反射率曲線は層状構造におけるFresnel理論を適応することによって求めることができる。すなわち、プリズム/金属層/コーティング層/測定試料の4層構造におけるFresnelの式によって求まる。
4層膜Fresnelの式の一般的な形は以下に示す通りである。Fresnel係数は
となり、次の式を用いて順々に計算を進めていく
ただし
δは位相膜厚,λは波長である。ただし、金属層の複素誘電率ε=ε,+1E,より複素屈折率を求め4層膜のときの反射率'Y1234を求める。
3.解析結果
表1に示す条件で解析を行った。測定波長760nmは、BIAcore社の装置に標準的に用いられている。金属膜厚d2=50nmが最適であると報告されている。これより薄くなると共鳴ピークはブロードになる。厚くすると、ピーク自体が浅くなる。この原因は、金属膜厚が薄すぎるときには表面プラズモン共鳴を起させても、表面プラズモンとして金属表面を伝播する前に全反射光になってしまうために共鳴ピークがばやけてしまい、結果として共鳴ピークが広がってしまうと考えられる。厚すぎると入射光が金属膜を通り抜けて反対側の表面での表面プラズモンを励起できなくなり、共鳴ピークが浅くなると考えられる。
図2は、典型的な表面プラズモン共鳴曲線である。この共鳴曲線の反射が最小となる角度が「共鳴角」となる。コーティング層の膜厚が増加するにつれ、共鳴角は大きくなることがわかる。実際のセンシングでは、第4層において特異的相互作用を起こさせる。この時、第4層の屈折率が変化し、共鳴角の変化となって相互作用を検出できる。本研究では、屈折率変化△n4(n4=1,3300・1.3305)に対する共鳴角変化Dqiを解析する。図3に典型的な、△n4と△θ1のプロットを示す。ここで示したように△n4が微小な場合には、共鳴角の変化は線形に変化する。このプロットの傾き△θ11△naを感度として定義する。△n4が大きい場合には、共鳴角の変化は線形にならない8)。
図4にコーティング膜の屈折率nsを変化させたときの感度を示す。コーティング層の膜厚daが小さいほど、屈折率nsの影響を受けにくい。膜厚dsが大きくなると屈折率naが大きいほど感度が大きくなる。しかし、膜厚が60nm以上、屈折率が1.60以上になると感度は大きくなるが共鳴曲線がブロードになり浅くなるため、この条件ではセンサーとしては信頼性に欠けるようになる。
図5にコーティング膜の膜厚daを変化させたときの感度を示す。屈折率na<1.53の場合、膜厚dsが薄いほど感度がよくなる。一方、屈折率na>1.53の場合、膜厚dsが厚いほど感度がよくなる。
しかし、この場合も図4の場合とどうように共鳴曲線がブロードかつ浅くなる。屈折率na=1.53の場合には、感度は膜厚daに依存しなくなる。この条件では再現性のよいチップを作製できると考えられる。
4.まとめ
表面プラズモン共鳴センサーのセンサーチップにおける金属コーティング膜として、プラズマ重合膜を想定し、その屈折率と膜厚がセンサー感度にどのような影響に与えるかについて理論解析を行った。屈折率ns=1.52の場合には、感度は膜厚に依存しなくなるのでチップの設計には有効である。現在、センサーチップの作製を行い理論正当性の検証、およびそのチップを用いたバイオセンサーの作製を行っている。