2013年[ 技術開発研究助成 (開発研究) ] 成果報告 ： 年報第27号
変換濃縮ストリッピング法を利用した単一細胞の活性評価システムの構築
概要
1.はじめに
生体分子計測において、分子認識反応(抗原一抗体免疫反応、相補的DNA、タンパク質相互作用等)の結果により変化する極わずかの化学物質を計測する技術の開発が、測定における高感度化に直結する。また、簡便で高感度に化学物質を計測する技術により、単一細胞レベルでの生体機能および活性評価が可能となる。よって、この技術の進歩が、生体分析、医療診断、環境分析および食品検査等の分野の発展に大きく寄与できることは簡単に予想できる。現在の電気化学計測装置の限界から1.0-10pAの電流変化を計測可能であるが、その電流変化を誘発するためには、電極表面で10-16-10-17mol/sの濃度変化を要する。すなわち、これ以下の濃度変化しか引き起こさない場合には、増幅システムを導入しない限り計測は不可能となる。これまでに、反応生成物を電極表面上のレドックス膜内に蓄積する手法1)-3)、電極表面改質後の触媒反応を利用する手法4)を提案した。しかし、1本の電極で蓄積濃縮とシグナル変換するためには初期電位の設定が極めて困難であった。そこで、本研究では、重要な生体分子認識反応に伴う化学物質の変化を、電気化学セルを介して電極表面上に蓄積し一括で電流信号へと変換する手法の開発を行った。この手法の有用性を明確に示すために、高感度免疫測定法の開発とシアノバクテリアの光合成活性の評価を行った。また,単一細胞を電極を配置した分析チャンバーへ導入するために電気泳動法5)を利用した。
免疫反応でターゲット分子を捕捉し酵素ラベルする。この酵素反応生成物を高感度に計測することにより、ターゲット分子を間接的に計測できる6)。電気化学セルを利用して酵素反応生成物を金属銀へと変換し電極表面上に蓄積する。この蓄積された金属銀を電気化学的に一括酸化溶出(ストリッピング)することにより電流シグナルへと変換する。酵素反応生成物を時間積分する技術に相当する。さらに、モデルのターゲット細胞として、シアノバクテリアの光合成活性計測を行った7い)。細胞からわずかに放出させる酸素分子を、難溶性の金属塩(ヨウ化銀)に変換し電極表面上に蓄積している。酸素の還元反応と銀の酸化に伴うヨウ化銀の析出反応(Ag+r→AgI+e-)を各電極で進行させる。このヨウ化銀を電気化学的に一括で還元溶出することにより、シグナルの増幅が可能になる。このシステムを用いて、農薬等の各種化学物質が細胞の光合成活性に与える影響について詳細に調査し、環境リスク評価のための高速スクリーニングを行った。
単一細胞レベルで生体機能を定量的に計測することは、生体機能に与える化学物質の影響を評価することができるため極めて重要である。さらに、細胞機能の評価システムの構築は、水環境に与える化学物質の毒性等のリスクマネージメントを円滑、高速に遂行することを可能にする。また、細胞を素子として捉えた薬剤の高速スクリーニングシステムの開発へとつながる9)。本手法は、細胞の光合成や呼吸に基づく酸素濃度変化を高感度に計測する技術の開発に相当し、これらの代謝活性を指標とした薬剤や毒物の細胞活性に与える影響を簡便に高感度で計測可能とする。
2.変換濃縮ストリッピング法による高感度免疫測定
2.1実験方法
ポリスチレンマイクロ粒子(直径1?m)の表面に存在するカルポキシル基を1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy1)carbodiimidehydrochlorideおよびN-hydroxysulfosuccinimideで活性化し、mouse monoclonal anti-CEA antibody(CEA antibody)を修飾した。さらに、非特異的な吸着を抑制するために10mg/mL bovine serum albumin(BSA)で処理した。抗体修飾微粒子懸濁液(100?L、5.3×1010particles/mL)に種々の濃度で調整したCEAの0.1Mリン酸緩衝液を混合し20分間インキュベートした。さらに、この微粒子を5.0?g/mL rabbit polyclonal anti-CEA antibody(CEA antibody)および1.0%goat polyclonal anti-IgG antibodyβ一galactosidase conjugate(anti-IgG antibodyβ一ga1)でそれぞれ20分間処理し酵素修飾した。最後に、粒子懸濁液に酵素(β一ga1)の基質である10mMp-aminopheny1-6-D-galactopyranoside(PAPG)を100?L加え、20分間インキュベートすることにより標識酵素の加水分解反応を利用してp-aminopheno1(PAP)を生成させた。
化学増幅システムを用いて生成されたPAPを検出した。図1に、マイクロ粒子表面での免疫複合体形成と免疫反応により捕捉されたβ一galの酵素反応により生成したPAPの電気化学計測法の概念図を示す。酵素反応後、遠心操作により微粒子を除去し、PAPGおよびPAPを含む溶液をカーボンIDA電極に導入した。IDA電極の各バンド電極の長さ、幅およびギャップ間隔は、それぞれ、2mm、10?mおよび5?mである。IDA電極の片側のバンドアレイ(W1)は、0.1mM硝酸銀を含むアンモニア緩衝液中に挿入されたグラッシーカーボン(GC)電極に接続した。もう一方のバンドアレイ(W2)は、ポテンショスタットに接続し一〇.1Vの一定電位を印加した。これは、PAPの電気化学的酸化により生成されたキノンイミン(QI)を近傍の電極で還元しPAPを再生するためである。両溶液を飽和硝酸カリウムで作製した塩橋で接続し、ガルバニセルを構築した。よって、IDA電極のW1はアノードとして作用するためPAPの酸化反応が進行し、GC電極はカソードとして作用し銀イオンの還元反応が進行する。セルを10分間接続し、酵素反応により生成したPAPを金属銀としてGC電極表面上に変換濃縮した。その後、GC電極上に析出した金属銀量を決定するため、掃引速度20mV!sでアノーディックストリッピングボルタンメトリーを行った。
2.2結果と考察
まず、金属銀への変換濃縮を利用したPAP計測を行った。本実験系において、PAPIQIの酸化還元電位が0.11Vで、Ag1Ag+が0.22Vであるため、アノード反応にPAPの酸化反応を利用することにより銀イオンは自発的に金属銀に還元されてGC表面上に析出する。図2Aに、異なる濃度のPAP存在下でガルバニセルによる変換濃縮反応の進行後のストリッピングボルタモグラムを示す。電極電位を正の方向に掃引すると、酸化電流が増加し0.2V付近に酸化ピークが現れ、その後、減少して0.25Vでほとんどゼ1コとなった。酸化電流は、PAP濃度の増加に伴って増加した。これは、PAP酸化による金属銀析出量が増加するためである。酸化電流応答を時間積分することにより算出された電荷量をPAP濃度に対してプロットした(図2Ca)。電荷量はPAP濃度に対して100-1、000nMの範囲で直線関係を示した。変換蓄積法により10分間析出させた金属銀を数秒で電流シグナルへと変換できるため、電流応答が増幅され高感度検出が可能になる。この変換濃縮システムを利用することにより、通常にサイクリックボルタンメトリー(CV)法と比較して1桁低濃度のPAP検出が可能であることがわかった。
図2Bに変換濃縮法に電気化学的レドックスサイクル法を組み合わせた2段階増幅システムにより得られた金属銀のストリッピングボルタモグラムを示す。このシステムでは、図1のW1でのPAP酸化反応により生成したQIをw2で還元しPAPを再生させている。これが、電気化学的レドックスサイクル法に相当する。図3Cbと挿入図は、図3Bで得られたストリッピング電流応答から得られた電荷量である。電荷量はPAP濃度の増加に伴い、直線的に増加した。2段階増幅システムで得られた電荷量は、レドックスサイクル法を組み込まなかった場合と比較して、シグナルは10-20倍大きかった。これは、電気化学的レドックスサイクリングによるPAPの再生反応に起因する。2段階増幅法で得られた10nMの検出限界は、通常のCV法での検出限界と比較して2桁小さい。変換濃縮法により1桁、レドックスサイクル法により1桁の感度向上が達成された。10nMPAPを用いて得られた電流応答は、わずか4pmo1のPAPの酸化に相当する。よって、酵素反応により生成されるPAPをこの変換濃縮法と電気化学的レドックスサイクル法を組み合わせた2段階増幅システムにより計測できると考えられる。
次に、電極表面に析出した金属銀のSEM観察を行った。2段階増幅法を用いて10分間、1?MPAPの酸化反応により金属銀を析出させた。図3AおよびBにGC電極表面に析出した金属銀のSEMイメージを示す。個々の銀粒子が電極表面上に存在し、その密度は9.1×107cr『であった。生成された粒子の最大直径は750nmであり、様々なサイズの粒子が観測された。図3Cに、ストリッピングボルタンメトリーを行った後のSEMイメージを示す。析出した金属銀が電気化学的酸化反応により除去されることがわかった。
2段階増幅システムを用いてマイクロ粒子上に構築されたサンドイッチ型免疫複合体のラベルとして用いたβ一gal酵素反応により生成したPAPの検出を行った。基質を導入し酵素反応を20分間進行させた後、マイクロ粒子を溶液から除去しIDA電極に導入した。図4Aに、CEA検出のためのストリッピングボルタモグラムを示す。この酸化電流は、酵素反応を介して生成したPAPの酸化によって析出した金属銀の電気化学溶出に起因する。図4Bに、CEA濃度に対する電荷量プロットを示す。応答はCEA濃度の増加に伴って増加する。0.1-10ng/mLのCEA濃度領域において電荷量に直線関係が得られた。高CEA濃度領域において、銀のストリッピングで得られる電荷量は、粒子表面に固定化された抗体へのCEAの捕捉が飽和するために起こると考えられる。2段階増幅システムを用いたCEAアッセイの感度は、通常の96ウェルマイクロタイタープレートを用いた酵素免疫測定法と比較して1桁の高感度化を達成した。また、メタロイムノアッセイ等の他の電気化学シグナル増幅システムを利用した手法と同程度の感度が達成できた。0.01ng/mL以下のCEAを用いた際に得られたバックグラウンドシグナルは、マイクロ粒子表面へのCEAや酵素標識抗体の非特異的な吸着に起因すると考えている。この手法の感度は、ヒト血清中において要求されている検出濃度(<25ng/mL)をカバーできている。よって、この手法は、わずかな酵素反応生成物を検出する方法として極めて優れている。
3.変換濃縮ストリッピング法によるシアノバクテリアの光合成活性計測
3.1実験方法
図5に、変換濃縮ストリッピング法によるシアノバクテリアの光合成活性計測の概念図を示す。96ウェルプレートのウェルに2.6×106cellsのシアノバクテリア(Microcystis viridis)を含むMll培地を導入した。このウェノレに白鍾極(直径1.6㎜)を挿入した。この白金電極を10mMヨウ化カリウムを含む硝酸カリウム溶液に浸漬させた銀電極と接続した。また、飽和硝酸カリウムを含む塩橋で両溶液間を接続しガルバニセルを構築した。よって、白金電極側はカソードとして作用し溶存酸素の還元反応が進行する。一方、銀電極側はアノ一ドとして作用し、銀イオンの酸化溶出に伴い難溶性のヨウ化銀の析出反応が進行する。この電池反応によりウェル内の溶存酸素はヨウ化銀として銀電極上に変換濃縮される。このデバイス全体を遮光したシールドケースに入れ、ウェルの底面にLEDライトを設置した。ウェル内のシアノバクテリアに光を照射すると、光合成により生成される酸素が電池反応によりヨウ化銀として銀電極表面上に濃縮される。このヨウ化銀をカソーディックストリッピングボルタンメトリー(掃引速度50mV/s)により計測した。光照射時間を5分とした。シアノバクテリア存在下において得られた電流応答から、細胞の存在しない場合の電流応答を差し引いて光合成による酸素生成量とした。
3.2結果と考察
まず、ストリッピング電流と電池接続時間の関係について調査した。アノードの白金電極とカソードの銀電極を接続し、銀電極上に析出したヨウ化銀をストリッピングボルタンメトリーにより還元した。図6に、異なる接続時間で電池反応を行った銀電極を用いて析出させたヨウ化銀のストリッピングボルタモグラムを示す。電位を負方向に掃引すると、-0.2V付近に還元電流ピークが観測され、その後ほぼゼロに戻った。接続時間の増加に伴い還元溶出電流ピークが大きくなることがわかる。
また、還元電流応答を時間積分して得られる電荷量は、接続時間(10秒一20分)に対して直線関係があった。また、異なる酸素濃度の溶液中で10秒間変換濃縮反応を進行させてヨウ化銀を析出させてストリッピングを行った。図7に、酸素濃度に対する反応電荷量を示す。溶液中の酸素濃度は、窒素バブリングにより調整し溶存酸素計で計測した。析出したヨウ化銀の還元電流応答は溶存酸素濃度の増加に伴い増加し、得られた電荷量は酸素濃度に対して直線関係を示した。これらのことから、溶存酸素の還元に連動して自発的にヨウ化銀の析出反応が進行し、溶存酸素量計測が可能であることがわかる。空気飽和時における水溶液中の酸素濃度は、8.llmg/Lである。
銀電極表面に析出したヨウ化銀のSEM観察を行った。図8に、ストリッピングによるヨウ化銀の溶出前後に得られたSEMイメージを示す。白金電極を空気飽和溶液に挿入し、5分間電池反応を進行させた。Ag電極表面には、直径1.0-2.9?mの粒子が観測された(図8AおよびB)。エネルギー分散型X線分析装置(EDXS)を用いて析出した粒子の元素分析を行ったところ、Agおよび1に起因するピークが観測された。一方、粒子の析出していない領域からは1に起因するピークは観測されなかった。よって、析出された粒子は難溶性塩であるヨウ化銀であることがわかる。ストリッピング後のAg電極表面には、析出されていた粒子がほとんど消失した(図8C)。以上により、蓄積変換されたAgIは、ストリッピングにより還元溶出されることが示された。
変換濃縮ストリッピング法を用いて、シアノバクテリアの光合成による酸素生成を評価した。図9Aに、シアノバクテリア存在下におけるストリッピングボルタモグラムを示す。照射した光強度を8,0001uxとした。光照射時に変換蓄積反応を進行させて得られたボルタモグラムは暗所と比較して大きい。これは、光照射時においてウェル内のシアノバクテリアが光合成により酸素を生成していることを示している。白金電極おける酸素の還元反応を4電子反応であると仮定すると、単一シアノバクテリアあたりの酸素生成速度は、6.1×10-1gmols-1cell-iと算出された。図9Bに、光強度に対する単一シアノバクテリアあたりの酸素生成速度を示す。酸素生成速度は光強度にほぼ比例することがわかる。
次に、除草剤である3-(3、4一ジク1コロフェニル)-1、1一ジメチル尿素(DCMU)の光合成活性に与える影響について調査した。図10に、異なる濃度のDCMU存在下で、光照射時に変換濃縮を行って得られたヨウ化銀のストリッピングボルタモグラムを示す。藍藻類へのDCMUの暴露濃度を0、0.1、0.5?M、暴露時間を30分間、光強度を8,0001UXに設定した。ヨウ化銀の還元溶出に伴うボルタモグラムは、DCMU濃度の増加に伴って減少した。一方、DCMUは暗所での変換蓄積によるヨウ化銀析出に影響を与えなかった。これは、DCMUにより光合成による酸素生成反応が阻害されたことを示している。以上により、藍藻類の光合成活性を指標とした除草剤濃度スクリーニングや多種多様な化学物質の毒性評価法として応用できる可能性が示された。
4.単一シアノバクテリアの光合成活性計測
4.1実験方法
2本の電極を組み込んだチャンバーを有するマイクロ流路デバイスを作製した。図llに、作製したデバイスの写真(図lIA)と電極を有するチャンバーの顕微鏡写真を示す。フォトリソグラフィーを用いてガラス基板上に金電極を作製し、SU-8でマイクロ流路構造を作製した。メインチャンネルには幅50?mのバンド電極を、チャンバー内には2つのマイクロ電極(ElとE2)を配置した。チャンバーの長さ、幅および高さを、150?mlength、10?mwidth、および20?mheightに設定した。メインチャンネルのバンド電極は、電気泳動により細胞をチャンバーに導入するためのグラウンドとして用いた。Elは、細胞を操作するための作用極および光合成の電気化学評価のための作用極として用いた。E2は、電気化学測定の対極として用いた。ElおよびE2の面積はどちらも10×10?m2である。ElとE2問の距離は10?mとした。ここでは、M11培地中で培養した超ゆocア8'∫3viridis(NIESlO2)を用いた。細胞の懸濁液を36?m/sの速度でメインチャンネルに導入した。メインチャンネルに配置したグラウンド電極に対して+2.OVの電圧をElに印加して細胞をチャンバーに導入した。電気化学計測のための参照電極である銀/塩化銀電極をアウトレットに設置した。細胞の光合成による酸素をアンペロメトリックに計測するために、電極電位を一〇.5Vにステップさせた。酸素の還元電流をモニターしながらLEDライトを用いて細胞に光照射(3,0001ux)した。
また、変換濃縮法を利用した単一シアノバクテリアの光合成活性評価を行った。ガラス基板上にSU-8製のマイクロウェルアレイを作製した。ウェルの直径および深さを25?mとした。ウェルに藻類を導入し白金マイクロ電極(直径20?m)を配置させて半密閉系を形成し酸素の変換を行った。マイクロ電極と銀電極を組み合わせたセルを構築し、酸素の還元反応の銀の酸化に伴うヨウ化銀の析出反応を組み合わせて10分間酸素をヨウ化銀へと変換濃縮した。その後、析出したヨウ化銀を還元ストリッピング(50mV/s)により計測した。
4.2結果と考察
電気泳動を用いてメインチャンネル内を流れる細胞をチャンバーに導入した。図llCに、導入時の細胞の顕微鏡写真を示す。El電極に+2.OVを印加すると、チャンバー付近に存在する負に帯電した細胞は電気泳動によりチャンバー内に誘導された。細胞の導入時の平均流速は47?m/sであった。チャンバーに導入された細胞は、電圧印加を停止してもチャンバー内にとどまった。El電極に一2.OVを印加することにより捕捉された細胞を容易に排出することができた(53?m/s)。
捕捉された細胞の光合成により放出される酸素をアンペロメトリックに計測した。図12に、酸素還元電流の経時変化を示す。23細胞を導入したチャンバーに光照射すると酸素還元電流は急激に増加してピークを形成し定常に達した(図12A)。光を消すと電流はもとのレベルに戻った。この応答は、光照射に伴う細胞の光合成によるチャンバー内酸素濃度の増加に起因する。ここで、細胞から放出される酸素がすべて電極で4電子還元されると仮定すると、単一細胞あたりの酸素生成速度は2.6×10-18mol/sと見積もることができた。図12Baに、チャンバーに1個の細胞を導入した際の電流変化を示す。光の照射および消光に同期して還元電流の増減が観測された。チャンバー内に細胞が存在しない場合には、この電流応答は観測されない(図12Bb)。40秒間の光照射で定常電流を得ることはできなかったが、酸素生成速度は少なくとも(2.1±0.8)×10'18mol/sと見積もれた。これは、複数細胞を計測した場合とほぼ一致している。マイクロ電極を組み込んだチャンバーを有するマイクロ流路デバイスを用いると、流れてくる目的とする細胞をチャンバー内に導入し、その個々の細胞の光合成活性を酸素還元電流から計測できることが示された。
最後に、マイクロ電極を用いた酸素の変換ストリッピング法による単一シアノバクテリアの光合成活性評価を行った。マイクロ電極を用いて溶存酸素をヨウ化銀へと変換しストリッピングボルタンメトリーを行ったところ、得られた電荷量は溶存酸素濃度に対しOmg/L～8.llmg/Lの範囲で直線的に増加した。このことから、マイクロ電極を用いた酸素の変換濃縮計測が可能であることが示された。マイクロウェルに細胞を導入し、マイクロ電極を配置させて酸素の変換濃縮を行った。8,0001uxの光を照射して10分間酸素の変換蓄積を行い、析出したヨウ化銀をストリッピングした。細胞を導入していないウェルで得られた電荷量と比較して明らかな電荷量の増加が観測された。ここから、細胞が10分間に光合成により放出した酸素量は約4fmolと算出された。よって、変換濃縮法を用いると単一細胞の光合成活性評価が可能であることを示せた。現在、再現性試験、光強度依存性および各種化学物質の光合成活性に与える影響について調査している。多数の単一細胞計測による光合成活性の統計的な評価を行うとともに、細胞活性を利用した環境評価システムの構築を目指す。
5.まとめ
本研究では、酵素反応生成物や生体反応による細胞からの生成物を金属や難溶性金属塩として電極表面上に変換蓄積し、シグナルを化学的に増幅することによる高感度計測システムの開発を行った。免疫測定では、抗原抗体反応を用いて捕捉した酵素の反応生成物であるPAPを酸化する際に、銀イオンの還元反応を組み合わせることによりPAPを金属銀に変換して蓄積した。この蓄積された金属銀を酸化溶出させて電流シグナルを取得する。この際、交互くし型電極を用いたレドックスサイクリング法を組み込むことにより、さらに検出下限濃度を向上させた。
この手法を用いて細胞の光合成による酸素生成速度を定量した。細胞をウェルに導入し、電気化学セルを用いて光合成により生成した酸素をヨウ化銀へと変換濃縮した。析出したヨウ化銀を還元溶出することにより酸素を高感度に定量できる。また、光合成電子伝達阻害剤を添加すると光合成による酸素生成が阻害されたため、この手法を用いると光合成活性を指標とした環境毒性評価およびスクリーニングシステムの構築が可能になる。
生体分子計測において、分子認識反応(抗原一抗体免疫反応、相補的DNA、タンパク質相互作用等)の結果により変化する極わずかの化学物質を計測する技術の開発が、測定における高感度化に直結する。また、簡便で高感度に化学物質を計測する技術により、単一細胞レベルでの生体機能および活性評価が可能となる。よって、この技術の進歩が、生体分析、医療診断、環境分析および食品検査等の分野の発展に大きく寄与できることは簡単に予想できる。現在の電気化学計測装置の限界から1.0-10pAの電流変化を計測可能であるが、その電流変化を誘発するためには、電極表面で10-16-10-17mol/sの濃度変化を要する。すなわち、これ以下の濃度変化しか引き起こさない場合には、増幅システムを導入しない限り計測は不可能となる。これまでに、反応生成物を電極表面上のレドックス膜内に蓄積する手法1)-3)、電極表面改質後の触媒反応を利用する手法4)を提案した。しかし、1本の電極で蓄積濃縮とシグナル変換するためには初期電位の設定が極めて困難であった。そこで、本研究では、重要な生体分子認識反応に伴う化学物質の変化を、電気化学セルを介して電極表面上に蓄積し一括で電流信号へと変換する手法の開発を行った。この手法の有用性を明確に示すために、高感度免疫測定法の開発とシアノバクテリアの光合成活性の評価を行った。また,単一細胞を電極を配置した分析チャンバーへ導入するために電気泳動法5)を利用した。
免疫反応でターゲット分子を捕捉し酵素ラベルする。この酵素反応生成物を高感度に計測することにより、ターゲット分子を間接的に計測できる6)。電気化学セルを利用して酵素反応生成物を金属銀へと変換し電極表面上に蓄積する。この蓄積された金属銀を電気化学的に一括酸化溶出(ストリッピング)することにより電流シグナルへと変換する。酵素反応生成物を時間積分する技術に相当する。さらに、モデルのターゲット細胞として、シアノバクテリアの光合成活性計測を行った7い)。細胞からわずかに放出させる酸素分子を、難溶性の金属塩(ヨウ化銀)に変換し電極表面上に蓄積している。酸素の還元反応と銀の酸化に伴うヨウ化銀の析出反応(Ag+r→AgI+e-)を各電極で進行させる。このヨウ化銀を電気化学的に一括で還元溶出することにより、シグナルの増幅が可能になる。このシステムを用いて、農薬等の各種化学物質が細胞の光合成活性に与える影響について詳細に調査し、環境リスク評価のための高速スクリーニングを行った。
単一細胞レベルで生体機能を定量的に計測することは、生体機能に与える化学物質の影響を評価することができるため極めて重要である。さらに、細胞機能の評価システムの構築は、水環境に与える化学物質の毒性等のリスクマネージメントを円滑、高速に遂行することを可能にする。また、細胞を素子として捉えた薬剤の高速スクリーニングシステムの開発へとつながる9)。本手法は、細胞の光合成や呼吸に基づく酸素濃度変化を高感度に計測する技術の開発に相当し、これらの代謝活性を指標とした薬剤や毒物の細胞活性に与える影響を簡便に高感度で計測可能とする。
2.変換濃縮ストリッピング法による高感度免疫測定
2.1実験方法
ポリスチレンマイクロ粒子(直径1?m)の表面に存在するカルポキシル基を1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy1)carbodiimidehydrochlorideおよびN-hydroxysulfosuccinimideで活性化し、mouse monoclonal anti-CEA antibody(CEA antibody)を修飾した。さらに、非特異的な吸着を抑制するために10mg/mL bovine serum albumin(BSA)で処理した。抗体修飾微粒子懸濁液(100?L、5.3×1010particles/mL)に種々の濃度で調整したCEAの0.1Mリン酸緩衝液を混合し20分間インキュベートした。さらに、この微粒子を5.0?g/mL rabbit polyclonal anti-CEA antibody(CEA antibody)および1.0%goat polyclonal anti-IgG antibodyβ一galactosidase conjugate(anti-IgG antibodyβ一ga1)でそれぞれ20分間処理し酵素修飾した。最後に、粒子懸濁液に酵素(β一ga1)の基質である10mMp-aminopheny1-6-D-galactopyranoside(PAPG)を100?L加え、20分間インキュベートすることにより標識酵素の加水分解反応を利用してp-aminopheno1(PAP)を生成させた。
化学増幅システムを用いて生成されたPAPを検出した。図1に、マイクロ粒子表面での免疫複合体形成と免疫反応により捕捉されたβ一galの酵素反応により生成したPAPの電気化学計測法の概念図を示す。酵素反応後、遠心操作により微粒子を除去し、PAPGおよびPAPを含む溶液をカーボンIDA電極に導入した。IDA電極の各バンド電極の長さ、幅およびギャップ間隔は、それぞれ、2mm、10?mおよび5?mである。IDA電極の片側のバンドアレイ(W1)は、0.1mM硝酸銀を含むアンモニア緩衝液中に挿入されたグラッシーカーボン(GC)電極に接続した。もう一方のバンドアレイ(W2)は、ポテンショスタットに接続し一〇.1Vの一定電位を印加した。これは、PAPの電気化学的酸化により生成されたキノンイミン(QI)を近傍の電極で還元しPAPを再生するためである。両溶液を飽和硝酸カリウムで作製した塩橋で接続し、ガルバニセルを構築した。よって、IDA電極のW1はアノードとして作用するためPAPの酸化反応が進行し、GC電極はカソードとして作用し銀イオンの還元反応が進行する。セルを10分間接続し、酵素反応により生成したPAPを金属銀としてGC電極表面上に変換濃縮した。その後、GC電極上に析出した金属銀量を決定するため、掃引速度20mV!sでアノーディックストリッピングボルタンメトリーを行った。
2.2結果と考察
まず、金属銀への変換濃縮を利用したPAP計測を行った。本実験系において、PAPIQIの酸化還元電位が0.11Vで、Ag1Ag+が0.22Vであるため、アノード反応にPAPの酸化反応を利用することにより銀イオンは自発的に金属銀に還元されてGC表面上に析出する。図2Aに、異なる濃度のPAP存在下でガルバニセルによる変換濃縮反応の進行後のストリッピングボルタモグラムを示す。電極電位を正の方向に掃引すると、酸化電流が増加し0.2V付近に酸化ピークが現れ、その後、減少して0.25Vでほとんどゼ1コとなった。酸化電流は、PAP濃度の増加に伴って増加した。これは、PAP酸化による金属銀析出量が増加するためである。酸化電流応答を時間積分することにより算出された電荷量をPAP濃度に対してプロットした(図2Ca)。電荷量はPAP濃度に対して100-1、000nMの範囲で直線関係を示した。変換蓄積法により10分間析出させた金属銀を数秒で電流シグナルへと変換できるため、電流応答が増幅され高感度検出が可能になる。この変換濃縮システムを利用することにより、通常にサイクリックボルタンメトリー(CV)法と比較して1桁低濃度のPAP検出が可能であることがわかった。
図2Bに変換濃縮法に電気化学的レドックスサイクル法を組み合わせた2段階増幅システムにより得られた金属銀のストリッピングボルタモグラムを示す。このシステムでは、図1のW1でのPAP酸化反応により生成したQIをw2で還元しPAPを再生させている。これが、電気化学的レドックスサイクル法に相当する。図3Cbと挿入図は、図3Bで得られたストリッピング電流応答から得られた電荷量である。電荷量はPAP濃度の増加に伴い、直線的に増加した。2段階増幅システムで得られた電荷量は、レドックスサイクル法を組み込まなかった場合と比較して、シグナルは10-20倍大きかった。これは、電気化学的レドックスサイクリングによるPAPの再生反応に起因する。2段階増幅法で得られた10nMの検出限界は、通常のCV法での検出限界と比較して2桁小さい。変換濃縮法により1桁、レドックスサイクル法により1桁の感度向上が達成された。10nMPAPを用いて得られた電流応答は、わずか4pmo1のPAPの酸化に相当する。よって、酵素反応により生成されるPAPをこの変換濃縮法と電気化学的レドックスサイクル法を組み合わせた2段階増幅システムにより計測できると考えられる。
次に、電極表面に析出した金属銀のSEM観察を行った。2段階増幅法を用いて10分間、1?MPAPの酸化反応により金属銀を析出させた。図3AおよびBにGC電極表面に析出した金属銀のSEMイメージを示す。個々の銀粒子が電極表面上に存在し、その密度は9.1×107cr『であった。生成された粒子の最大直径は750nmであり、様々なサイズの粒子が観測された。図3Cに、ストリッピングボルタンメトリーを行った後のSEMイメージを示す。析出した金属銀が電気化学的酸化反応により除去されることがわかった。
2段階増幅システムを用いてマイクロ粒子上に構築されたサンドイッチ型免疫複合体のラベルとして用いたβ一gal酵素反応により生成したPAPの検出を行った。基質を導入し酵素反応を20分間進行させた後、マイクロ粒子を溶液から除去しIDA電極に導入した。図4Aに、CEA検出のためのストリッピングボルタモグラムを示す。この酸化電流は、酵素反応を介して生成したPAPの酸化によって析出した金属銀の電気化学溶出に起因する。図4Bに、CEA濃度に対する電荷量プロットを示す。応答はCEA濃度の増加に伴って増加する。0.1-10ng/mLのCEA濃度領域において電荷量に直線関係が得られた。高CEA濃度領域において、銀のストリッピングで得られる電荷量は、粒子表面に固定化された抗体へのCEAの捕捉が飽和するために起こると考えられる。2段階増幅システムを用いたCEAアッセイの感度は、通常の96ウェルマイクロタイタープレートを用いた酵素免疫測定法と比較して1桁の高感度化を達成した。また、メタロイムノアッセイ等の他の電気化学シグナル増幅システムを利用した手法と同程度の感度が達成できた。0.01ng/mL以下のCEAを用いた際に得られたバックグラウンドシグナルは、マイクロ粒子表面へのCEAや酵素標識抗体の非特異的な吸着に起因すると考えている。この手法の感度は、ヒト血清中において要求されている検出濃度(<25ng/mL)をカバーできている。よって、この手法は、わずかな酵素反応生成物を検出する方法として極めて優れている。
3.変換濃縮ストリッピング法によるシアノバクテリアの光合成活性計測
3.1実験方法
図5に、変換濃縮ストリッピング法によるシアノバクテリアの光合成活性計測の概念図を示す。96ウェルプレートのウェルに2.6×106cellsのシアノバクテリア(Microcystis viridis)を含むMll培地を導入した。このウェノレに白鍾極(直径1.6㎜)を挿入した。この白金電極を10mMヨウ化カリウムを含む硝酸カリウム溶液に浸漬させた銀電極と接続した。また、飽和硝酸カリウムを含む塩橋で両溶液間を接続しガルバニセルを構築した。よって、白金電極側はカソードとして作用し溶存酸素の還元反応が進行する。一方、銀電極側はアノ一ドとして作用し、銀イオンの酸化溶出に伴い難溶性のヨウ化銀の析出反応が進行する。この電池反応によりウェル内の溶存酸素はヨウ化銀として銀電極上に変換濃縮される。このデバイス全体を遮光したシールドケースに入れ、ウェルの底面にLEDライトを設置した。ウェル内のシアノバクテリアに光を照射すると、光合成により生成される酸素が電池反応によりヨウ化銀として銀電極表面上に濃縮される。このヨウ化銀をカソーディックストリッピングボルタンメトリー(掃引速度50mV/s)により計測した。光照射時間を5分とした。シアノバクテリア存在下において得られた電流応答から、細胞の存在しない場合の電流応答を差し引いて光合成による酸素生成量とした。
3.2結果と考察
まず、ストリッピング電流と電池接続時間の関係について調査した。アノードの白金電極とカソードの銀電極を接続し、銀電極上に析出したヨウ化銀をストリッピングボルタンメトリーにより還元した。図6に、異なる接続時間で電池反応を行った銀電極を用いて析出させたヨウ化銀のストリッピングボルタモグラムを示す。電位を負方向に掃引すると、-0.2V付近に還元電流ピークが観測され、その後ほぼゼロに戻った。接続時間の増加に伴い還元溶出電流ピークが大きくなることがわかる。
また、還元電流応答を時間積分して得られる電荷量は、接続時間(10秒一20分)に対して直線関係があった。また、異なる酸素濃度の溶液中で10秒間変換濃縮反応を進行させてヨウ化銀を析出させてストリッピングを行った。図7に、酸素濃度に対する反応電荷量を示す。溶液中の酸素濃度は、窒素バブリングにより調整し溶存酸素計で計測した。析出したヨウ化銀の還元電流応答は溶存酸素濃度の増加に伴い増加し、得られた電荷量は酸素濃度に対して直線関係を示した。これらのことから、溶存酸素の還元に連動して自発的にヨウ化銀の析出反応が進行し、溶存酸素量計測が可能であることがわかる。空気飽和時における水溶液中の酸素濃度は、8.llmg/Lである。
銀電極表面に析出したヨウ化銀のSEM観察を行った。図8に、ストリッピングによるヨウ化銀の溶出前後に得られたSEMイメージを示す。白金電極を空気飽和溶液に挿入し、5分間電池反応を進行させた。Ag電極表面には、直径1.0-2.9?mの粒子が観測された(図8AおよびB)。エネルギー分散型X線分析装置(EDXS)を用いて析出した粒子の元素分析を行ったところ、Agおよび1に起因するピークが観測された。一方、粒子の析出していない領域からは1に起因するピークは観測されなかった。よって、析出された粒子は難溶性塩であるヨウ化銀であることがわかる。ストリッピング後のAg電極表面には、析出されていた粒子がほとんど消失した(図8C)。以上により、蓄積変換されたAgIは、ストリッピングにより還元溶出されることが示された。
変換濃縮ストリッピング法を用いて、シアノバクテリアの光合成による酸素生成を評価した。図9Aに、シアノバクテリア存在下におけるストリッピングボルタモグラムを示す。照射した光強度を8,0001uxとした。光照射時に変換蓄積反応を進行させて得られたボルタモグラムは暗所と比較して大きい。これは、光照射時においてウェル内のシアノバクテリアが光合成により酸素を生成していることを示している。白金電極おける酸素の還元反応を4電子反応であると仮定すると、単一シアノバクテリアあたりの酸素生成速度は、6.1×10-1gmols-1cell-iと算出された。図9Bに、光強度に対する単一シアノバクテリアあたりの酸素生成速度を示す。酸素生成速度は光強度にほぼ比例することがわかる。
次に、除草剤である3-(3、4一ジク1コロフェニル)-1、1一ジメチル尿素(DCMU)の光合成活性に与える影響について調査した。図10に、異なる濃度のDCMU存在下で、光照射時に変換濃縮を行って得られたヨウ化銀のストリッピングボルタモグラムを示す。藍藻類へのDCMUの暴露濃度を0、0.1、0.5?M、暴露時間を30分間、光強度を8,0001UXに設定した。ヨウ化銀の還元溶出に伴うボルタモグラムは、DCMU濃度の増加に伴って減少した。一方、DCMUは暗所での変換蓄積によるヨウ化銀析出に影響を与えなかった。これは、DCMUにより光合成による酸素生成反応が阻害されたことを示している。以上により、藍藻類の光合成活性を指標とした除草剤濃度スクリーニングや多種多様な化学物質の毒性評価法として応用できる可能性が示された。
4.単一シアノバクテリアの光合成活性計測
4.1実験方法
2本の電極を組み込んだチャンバーを有するマイクロ流路デバイスを作製した。図llに、作製したデバイスの写真(図lIA)と電極を有するチャンバーの顕微鏡写真を示す。フォトリソグラフィーを用いてガラス基板上に金電極を作製し、SU-8でマイクロ流路構造を作製した。メインチャンネルには幅50?mのバンド電極を、チャンバー内には2つのマイクロ電極(ElとE2)を配置した。チャンバーの長さ、幅および高さを、150?mlength、10?mwidth、および20?mheightに設定した。メインチャンネルのバンド電極は、電気泳動により細胞をチャンバーに導入するためのグラウンドとして用いた。Elは、細胞を操作するための作用極および光合成の電気化学評価のための作用極として用いた。E2は、電気化学測定の対極として用いた。ElおよびE2の面積はどちらも10×10?m2である。ElとE2問の距離は10?mとした。ここでは、M11培地中で培養した超ゆocア8'∫3viridis(NIESlO2)を用いた。細胞の懸濁液を36?m/sの速度でメインチャンネルに導入した。メインチャンネルに配置したグラウンド電極に対して+2.OVの電圧をElに印加して細胞をチャンバーに導入した。電気化学計測のための参照電極である銀/塩化銀電極をアウトレットに設置した。細胞の光合成による酸素をアンペロメトリックに計測するために、電極電位を一〇.5Vにステップさせた。酸素の還元電流をモニターしながらLEDライトを用いて細胞に光照射(3,0001ux)した。
また、変換濃縮法を利用した単一シアノバクテリアの光合成活性評価を行った。ガラス基板上にSU-8製のマイクロウェルアレイを作製した。ウェルの直径および深さを25?mとした。ウェルに藻類を導入し白金マイクロ電極(直径20?m)を配置させて半密閉系を形成し酸素の変換を行った。マイクロ電極と銀電極を組み合わせたセルを構築し、酸素の還元反応の銀の酸化に伴うヨウ化銀の析出反応を組み合わせて10分間酸素をヨウ化銀へと変換濃縮した。その後、析出したヨウ化銀を還元ストリッピング(50mV/s)により計測した。
4.2結果と考察
電気泳動を用いてメインチャンネル内を流れる細胞をチャンバーに導入した。図llCに、導入時の細胞の顕微鏡写真を示す。El電極に+2.OVを印加すると、チャンバー付近に存在する負に帯電した細胞は電気泳動によりチャンバー内に誘導された。細胞の導入時の平均流速は47?m/sであった。チャンバーに導入された細胞は、電圧印加を停止してもチャンバー内にとどまった。El電極に一2.OVを印加することにより捕捉された細胞を容易に排出することができた(53?m/s)。
捕捉された細胞の光合成により放出される酸素をアンペロメトリックに計測した。図12に、酸素還元電流の経時変化を示す。23細胞を導入したチャンバーに光照射すると酸素還元電流は急激に増加してピークを形成し定常に達した(図12A)。光を消すと電流はもとのレベルに戻った。この応答は、光照射に伴う細胞の光合成によるチャンバー内酸素濃度の増加に起因する。ここで、細胞から放出される酸素がすべて電極で4電子還元されると仮定すると、単一細胞あたりの酸素生成速度は2.6×10-18mol/sと見積もることができた。図12Baに、チャンバーに1個の細胞を導入した際の電流変化を示す。光の照射および消光に同期して還元電流の増減が観測された。チャンバー内に細胞が存在しない場合には、この電流応答は観測されない(図12Bb)。40秒間の光照射で定常電流を得ることはできなかったが、酸素生成速度は少なくとも(2.1±0.8)×10'18mol/sと見積もれた。これは、複数細胞を計測した場合とほぼ一致している。マイクロ電極を組み込んだチャンバーを有するマイクロ流路デバイスを用いると、流れてくる目的とする細胞をチャンバー内に導入し、その個々の細胞の光合成活性を酸素還元電流から計測できることが示された。
最後に、マイクロ電極を用いた酸素の変換ストリッピング法による単一シアノバクテリアの光合成活性評価を行った。マイクロ電極を用いて溶存酸素をヨウ化銀へと変換しストリッピングボルタンメトリーを行ったところ、得られた電荷量は溶存酸素濃度に対しOmg/L～8.llmg/Lの範囲で直線的に増加した。このことから、マイクロ電極を用いた酸素の変換濃縮計測が可能であることが示された。マイクロウェルに細胞を導入し、マイクロ電極を配置させて酸素の変換濃縮を行った。8,0001uxの光を照射して10分間酸素の変換蓄積を行い、析出したヨウ化銀をストリッピングした。細胞を導入していないウェルで得られた電荷量と比較して明らかな電荷量の増加が観測された。ここから、細胞が10分間に光合成により放出した酸素量は約4fmolと算出された。よって、変換濃縮法を用いると単一細胞の光合成活性評価が可能であることを示せた。現在、再現性試験、光強度依存性および各種化学物質の光合成活性に与える影響について調査している。多数の単一細胞計測による光合成活性の統計的な評価を行うとともに、細胞活性を利用した環境評価システムの構築を目指す。
5.まとめ
本研究では、酵素反応生成物や生体反応による細胞からの生成物を金属や難溶性金属塩として電極表面上に変換蓄積し、シグナルを化学的に増幅することによる高感度計測システムの開発を行った。免疫測定では、抗原抗体反応を用いて捕捉した酵素の反応生成物であるPAPを酸化する際に、銀イオンの還元反応を組み合わせることによりPAPを金属銀に変換して蓄積した。この蓄積された金属銀を酸化溶出させて電流シグナルを取得する。この際、交互くし型電極を用いたレドックスサイクリング法を組み込むことにより、さらに検出下限濃度を向上させた。
この手法を用いて細胞の光合成による酸素生成速度を定量した。細胞をウェルに導入し、電気化学セルを用いて光合成により生成した酸素をヨウ化銀へと変換濃縮した。析出したヨウ化銀を還元溶出することにより酸素を高感度に定量できる。また、光合成電子伝達阻害剤を添加すると光合成による酸素生成が阻害されたため、この手法を用いると光合成活性を指標とした環境毒性評価およびスクリーニングシステムの構築が可能になる。