1999年[ 技術開発研究助成 ] 成果報告 ： 年報第13号
医療用マイクロバイオセンサーシステム
概要
1.はじめに
バイオセンサーは生体材料のもつきわめて優れた分子識別能力を利用して化学物質の濃度を測定するセンサーである。原理的にはこのバイオセンサーのチャンネル数を増やし,集積型にすることによって測定対象物質の種類を増やすことができる。これにより種々の酵素基質・抗原・DNAなどを同時に測定可能となるだけでなく,匂いや味といった生物感覚器を構築できる可能性もでてくる。こうしたセンサーの作製には,生体材料である酵素や抗体などの識別素子の固定化が必要である。これまでの主な方法は,異なる種類の生体材料を順次それぞれ個別に基板に配置し固定化していた。この方法では,センサーの微小化や固定化生体材料の種類の増加に対応することが困難であった。そこで本研究では,異なる種類の生体材料を同時に一括して固定化できる方法の開発を目的とする。この目的を実現させるために,材料の配置操作に自己組立ての手法を採用した。つまり,配置操作は対象が微小になってくると,配置させる部品と配置させる側になんらかの親和力をもたせ,この力を利用して会合構築させる(自己組立て)方が効率よくなるからである。このような方法を用いてシステムを構築した報告としては,重力,磁気力,表面張力,横毛管力,親水性疎水性,静電気力,生体材料の特異的親和力を用いたものなどがある。なお,このうちバイオセンサーの作製に利用されたものは,2件だけである。多チャンネルを実現するためには構築の繁雑さなしに,多くの構成要素を一度に構築する技術が必要になってくる。そこで,センサーの作製には微細な加工や,一度に同じ構成要素を多く構築することが可能な技術である微細加工技術を用いた。この技術は半導体産業において半導体集積回路など多くの電子部品の作製に用いられている。この技術を多チャンネルの集積型センサー構築に用いると,センサーチャンネルが数万単位になった場合でもセンサーの測定部分の大きさは数センチメートル以内に微小化することができる。また,今までの微細加工技術や自己組立てを利用した集積化センサーの研究は,検出方法が光によるものであり,電気化学的な検出を行った報告はない。そこで本研究では電気化学的な検出も可能な集積型バイオセンサーの開発を行った。特に,識別素子である酵素をガラスビーズ担体に固定化し,このガラスビーズを基板に配置することによって,センサー素子に応用することを試みた。この担体を基板に配置し,酵素触媒による発光を検出することによってセンサーとして利用できることを検討した。このために,基板をフォトファブリケーションによって作製し,ガラスビーズへの酵素固定化の検討をした。また,集積化が可能であるかを調べるために,複数の酵素を用いて基質により異なる反応が起こることを検討した。
2.集積型バイオセンサーの構築
2.1.実験に用いた試薬,材料
本研究で使用した試薬,および材料は次のとおりである。ペルオキシダーゼ(POD:西洋ワサビ由来,和光純薬工業)とグルコースオキシダーゼ(GOD:和光純薬工業)を反応の触媒として用いた。酵素固定化のためのビーズ洗浄用に水酸化カリウム(和光純薬工業)を用いた。酵素の固定化にはトルエン(和光純薬工業),グルタルアルデヒド(25%,和光純薬工業),3一アミノプロピルエトキシシラン(γ一APTES:信越化学工業)を用いた。ガラス基板の洗浄にはアセトン(電子工業用,関東化学),イソプロピルアルコール(IPA:電子工業用,関東化学)を用いた。フォトリソグラフィーに用いたレジストは厚膜用ネガレジストSU-850 (MicroChem Corp),現像液にはSU-8 Developer (MicroChem Corp)を用い,剥離液にはSU-8 Remover (MicroChem Corp)を用いた。またネガ型レジストでOMR85レジスト(東京応化工業),その現像液(東京応化工業),レジストを剥離するときに,クリーンストリップリンスHP(東京応化工業),ストリップリンス(東京応化工業)を用いた。また,化学発光試薬にルミノール(生化学用,和光純薬工業),助触媒となるp一ヨードフェノール・(東京化成」二業),反応の酸化剤として過酸化水素(30%水溶液,生化学用,和光純薬工業)を用いた。センサーの基板に厚さ1.2～1.5mm,76×26mmの形状のMicro Slide Glass(Matsunami)を用いた。酵素を固定化する担体には直径が100,umのガラスビーズ(井内)を用いた。また,基板に薄膜を蒸着するために蒸着装置(昭和小型真空蒸着装置)を使用した。フォトファブリケーションのための装置として,レジストを塗布するためにスピンコーター(IH-DX,MIKASA),ベイクするためのオ一プン(DK300,Yamato),露光するためのマスクアライナー(MUB3,KARLSUSS)を使用した。ガラスビーズの配列確認に実体顕微鏡(OPTIPHOT-2,Nikon)を用いた。発光反応を検出するために化学発光検出器(ARGUS50,浜松ホトニクス)を用いた。作製したレジスト形状を測定する装置に表面粗さ計(Dektak3030,fi本真空技術株式会社)を用いた。
2.2.センサーの作製方法
本研究で作製し,使用したセンサー概略をFigure2.1に示す。構成は酵素を固定化するための担体であるガラスビーズ,それを配置するためのガラス基板からなっている。担体の形状は,直径が100μmで水に沈澱可能である。基板はフォトファブリケーションにより作製し,担体が入るためのチャンバー,またその中に電極が配線された構造になっている。この担体と基板を組み合わせることによりセンサーとして利用する。このセンサーの検出方法は,酵素触媒反応によっておこる蛍光検出と酸化還元反応による電気検出の複合的検出を可能にすることを考えた。以下に,センサー作製の手順を示す。
2.2.1センサー基板の作製
センサー基板の作製をFigure2,2と以下に示す。
[1]基板の洗浄
ガラス基板を中性洗剤(コンタミノン,Wako)を用いて洗浄し,比較的大きな汚染物質を取り除いた。次に,基板を超純水に浸し,5分間超音波洗浄し,極性汚れを取り除いた。さらに,非極性の汚れを取り除くために,IPA(イソプロピルアルコール),アセトン,IPAの順でそれぞれ5分間同じ様に超音波洗浄した。最後に超純水で5分間超音波洗浄した。この後,基板をホットプレートで200QC,10分間加熱し基板に残った水分を取り除いた。
[2]電極の蒸着
蒸着装置を用いて107～106torrの真空状態で,センサー電極を作製するためにクロム200A,金1000aをガラス基板に蒸着した。
[3]電極作製のためのレジストパターン作製
フォトマスクをAdobe Illustratorで作製した(3000dpi相当,山田製版)。スピンコータを用いてネガ型レジストOMR-85を基板上に均一に塗布した。この基板をホットプレートで加熱し,予め作製したマスクパターンを用いて,露光し,現像することにより任意のレジストパターンを得た。
(OMR…85)べ一ク:ホットプレート200℃15分HMDS塗布:スピナー初速:300rpm 3s, slope:2s,本速:4000rpm 20s, slope:2s終速:6000rpm 2s, slope:2s HMDSプリベーク:ホットプレート110℃3分塗布:スピナー初速:300rpm 3s, slope:2s,本速:4000rpm 20s, slope:2s終速:6000rpm 2s, slope:2sソフトベイク:ホットプレート110℃ 3分露光:マスクアライナー0.4s(露光装置の出力が13.lmWの時)ポストベイクニオーブン125℃20分現像:OMR-85現像液2分OMR-85リンス1分純水1分OMR-85除去:クリーンストリップ120℃ 1分ストリップリンス1分アセトン1分水洗い
[4]エッチングによる電極形状の作製
レジストパターンが形成してある基板を金,クロムの溶解液(エッチング液)に5分間浸した。基板上のレジストを剥離することにより,電極パターンを作製した。金はエッチング液(ヨウ化カリウム40g,よう素10g,水400mL),クロムはエッチング液(水酸化ナトリウム40g,フエリシアン化カリウム1008,水400mL)を用いた。
[5]レジストパターンによるセンサーチャンバーの作製
ネガ型レジストSU-8(50) を用い,[3]でおこなった謬工程手順でレジストパターンを作製した。以下にそれぞれの」二程での設定値を記した。
(SU-8)べ一ク:ホットプレート200℃15分塗布:スピナー初速度:500rpm 10s, slope:10s,本速度:2000rpm 20s, slope:5sポストベイク:ホットプレート100℃20分露光:マスクアライナー17s(露光装置の出力が13,lmWの時)ハードベイク:ホットプレート100℃15分以.上の[1]～[5]のステップを踏むことにより,センサー基板を作製した。
2.2.2ガラスビーズへの酵素固定化酵素のガラスビーズへの固定化方法をFigure2.3に示す。直径約100μmのガラスビーズを200メッシュのふるいにかけたのち,10%水酸化カリウム溶液中,室温で数時間撹絆し,洗浄した。これを10%γ一APTESトルエン溶液で終夜還流し,濾紙にとってトルエンで洗浄した。さらに115℃で4時間加熱したのち,2.5%グルタルアルデヒド(GA)を含むリン酸緩衝液(pH7.1)中で1時間反応させた。洗浄後,10%PODを含むリン酸緩衝溶液中に終夜浸し固定化した。
2.3担体に固定化した酵素活性の測定方法グルコースオキシダーゼ(GOD),ペルオキシダーゼ(POD),およびその両方固定化した3種類のビーズを準備した。P一ヨードブSノール0.13mM,ルミノール1mMの混合溶液の中に基板を浸し,その基板のチャンバー内にそれぞれのビーズを入れた。この溶液中にグルコースを入れるとFigure2.4(1)の2段階の酵素反応が起こりGODとPODを固定化したビーズの発光が起こることを確認した。また,過酸化水素を入れるとFigure2.4(2)の反応が起こり,GODとPODを固定化したビーズ,PODのみを固定化したビーズで発光が起こることを確認した。なお,発光は2次元高感度化学発光系計測システムにて測定した。
3.結果および考察
3.1センサー基板の作製
作製したセンサー基板の写真をFigure2.5に示す。
作製手順[2]において,蒸着の真空度は高い程,作製膜や装置のチャンバー内の蒸着による汚れを防ぐためにもよいか,排気に時間かかかるため,真空度は約107torrにした。なお,作製手順[4]のエッチング速度は,レジストパターンの大きさ形状によって異なってくる。
3.2酵素固定化の検討
今回用いた生体材料は酵素であり,固定化においては,酸素の表面密度や,酵素の配向性などが重要になってくる。すなわち,生体材料は十分な量固定化されなければ実用的に利用できない。また,固定化によって立体構造が変化し,酵素としての機能が働かなかったり,配向が適当でないと,活性部位が露出していない状態になることが考えられる。このため,本研究で使用した酵素固定化担体か反応触媒として利用可能であることをルミノール発光により検討した。ペルオキシダーゼの活性の最適pHは6,0～6.5であり,ルミノールの発光の最適pHは10～11である。このためまず,使用する反応系での最適なpHを求めた。Figure2.6は1mMルミノール5ml,0.13mMパラヨードフェノール1ml,1mM過酸化水素0.2mIの混合溶液中にペルオキシダーゼを固定化した酵素を入れ,ルミノール発光を2次元高感度化学発光系計測システムにて測定した結果である。pH7.5,8.0,8.5の3種類を調べた。pH7.5で発光は得られず,pH8.0,8.5の両方で発光が測定されたが,Figure2.6より,pH8.0でより高い発光が得られていることがわかった。このため,以後のルミノール発光を利用した実験ではpH8.0でおこなった。
3.3センサーの集積化
センサーの集積化によって,異なる酵素が固定化してあるチャンネル間の距離が短くなり,複数のチャンネルの相互作用が問題となることが考えられる。グルコースオキシダーゼ(GOD),ペルオキシダーゼ(POD),とその両方固定化した3種類のビーズを用いて,酵素の触媒反応によるルミノール発光を測定した。Figure2.7のBのビーズで起こる反応は,Figure2.4の(1)のPODとGODによる2段階反応式である。このように,Figure2.7のCのビーズで起こる反応は,Figure2.4の(2)と対応している。この実験の結果より,同じ担体に2種類の酵素を固定化した場合は,グルコースを加えてルミノール発光がBのビーズから得られたことから,2段階の酵素反応を行なえることがわかった。また,もし,Bのビーズ.上で生成した過酸化水素がCのビーズまで十分な量で拡散すれば,C上でも化学発光が見られるはずである。しかし,Cでは化学発光が見られていない。このことから,担体が図のように離れている場合に相互作用は起こらないことがわかった。このように,同じルミノールの発光反応溶液中で2種類の反応が検出できることが示された。
3.4センサー電極による還元電位測定
Figure2.8は作製したセンサーを50mM,100m1リン酸緩衝液中に浸した。この中に100mMの過酸化水素を40秒間隔で0.5m1づつ加えていき,酸化還元電流値をクロノアンペロメトリーで測定した結果である。この結果により,本研究で作製した,センサーチップを用いて過酸化水素の濃度測定ができることが分かった。このセンサーチップのチャンバー内で,過酸化水素が生成する反応が起きれば電気信号として検出できることがわかる。グルコースのGODによる触媒反応で過酸化水素が生成することがわかっている。したがって,GODを固定化したビーズをセンサーのチャンバー内に配置すれば,グルコースの電気化学的検出が可能になると考え実験を行なってみた。しかし,この実験結果からは応答が得られなかった。この原因として,反応によって生成される過酸化水素の濃度が低いことや,配置されたガラスビーズと電極との距離が離れていたことが考えられた。したがって電気化学的な検出をするためには,電極上に直接生体材料を固定化する必要があると考えられた。
4.結言
以下に本研究で得られた結果をまとめる。
(1)厚膜用レジストSU-8を用いてレジストパターンを作製した。膜厚が約80μmのものが得られた。レジスト塗布を繰り返すことによってさらに厚い膜を形成することができると考えられる。
(2)水溶液中で100μmのガラスビーズをSU-8で作製したレジストパターンのウェルにビーズの重力によって配置することができた。
(3)ガラスビーズ担体にγ一APTESの化学修飾を用いて酵素を固定化することができた。また,この固定化した酵素が触媒反応として使用できることがルミノール発光によって確認された。
(4)酵素をビーズに固定化し,それぞれ別々のセンサーチャンバーに配置することによって,反応の相互作用が起こらなかったことから,それぞれのチャンバーにおいて孤立した反応系を作ることができた。これを集積型バイオセンサーに応用できることがわかった。
以上より,酵素をガラスビーズに固定化し,今回の実験のようにパターン状にビーズを配置させれば,異なる反応リアクターとして利用可能であることがわかり,集積型バイオセンサーに応用できることが示唆された。
バイオセンサーは生体材料のもつきわめて優れた分子識別能力を利用して化学物質の濃度を測定するセンサーである。原理的にはこのバイオセンサーのチャンネル数を増やし,集積型にすることによって測定対象物質の種類を増やすことができる。これにより種々の酵素基質・抗原・DNAなどを同時に測定可能となるだけでなく,匂いや味といった生物感覚器を構築できる可能性もでてくる。こうしたセンサーの作製には,生体材料である酵素や抗体などの識別素子の固定化が必要である。これまでの主な方法は,異なる種類の生体材料を順次それぞれ個別に基板に配置し固定化していた。この方法では,センサーの微小化や固定化生体材料の種類の増加に対応することが困難であった。そこで本研究では,異なる種類の生体材料を同時に一括して固定化できる方法の開発を目的とする。この目的を実現させるために,材料の配置操作に自己組立ての手法を採用した。つまり,配置操作は対象が微小になってくると,配置させる部品と配置させる側になんらかの親和力をもたせ,この力を利用して会合構築させる(自己組立て)方が効率よくなるからである。このような方法を用いてシステムを構築した報告としては,重力,磁気力,表面張力,横毛管力,親水性疎水性,静電気力,生体材料の特異的親和力を用いたものなどがある。なお,このうちバイオセンサーの作製に利用されたものは,2件だけである。多チャンネルを実現するためには構築の繁雑さなしに,多くの構成要素を一度に構築する技術が必要になってくる。そこで,センサーの作製には微細な加工や,一度に同じ構成要素を多く構築することが可能な技術である微細加工技術を用いた。この技術は半導体産業において半導体集積回路など多くの電子部品の作製に用いられている。この技術を多チャンネルの集積型センサー構築に用いると,センサーチャンネルが数万単位になった場合でもセンサーの測定部分の大きさは数センチメートル以内に微小化することができる。また,今までの微細加工技術や自己組立てを利用した集積化センサーの研究は,検出方法が光によるものであり,電気化学的な検出を行った報告はない。そこで本研究では電気化学的な検出も可能な集積型バイオセンサーの開発を行った。特に,識別素子である酵素をガラスビーズ担体に固定化し,このガラスビーズを基板に配置することによって,センサー素子に応用することを試みた。この担体を基板に配置し,酵素触媒による発光を検出することによってセンサーとして利用できることを検討した。このために,基板をフォトファブリケーションによって作製し,ガラスビーズへの酵素固定化の検討をした。また,集積化が可能であるかを調べるために,複数の酵素を用いて基質により異なる反応が起こることを検討した。
2.集積型バイオセンサーの構築
2.1.実験に用いた試薬,材料
本研究で使用した試薬,および材料は次のとおりである。ペルオキシダーゼ(POD:西洋ワサビ由来,和光純薬工業)とグルコースオキシダーゼ(GOD:和光純薬工業)を反応の触媒として用いた。酵素固定化のためのビーズ洗浄用に水酸化カリウム(和光純薬工業)を用いた。酵素の固定化にはトルエン(和光純薬工業),グルタルアルデヒド(25%,和光純薬工業),3一アミノプロピルエトキシシラン(γ一APTES:信越化学工業)を用いた。ガラス基板の洗浄にはアセトン(電子工業用,関東化学),イソプロピルアルコール(IPA:電子工業用,関東化学)を用いた。フォトリソグラフィーに用いたレジストは厚膜用ネガレジストSU-850 (MicroChem Corp),現像液にはSU-8 Developer (MicroChem Corp)を用い,剥離液にはSU-8 Remover (MicroChem Corp)を用いた。またネガ型レジストでOMR85レジスト(東京応化工業),その現像液(東京応化工業),レジストを剥離するときに,クリーンストリップリンスHP(東京応化工業),ストリップリンス(東京応化工業)を用いた。また,化学発光試薬にルミノール(生化学用,和光純薬工業),助触媒となるp一ヨードフェノール・(東京化成」二業),反応の酸化剤として過酸化水素(30%水溶液,生化学用,和光純薬工業)を用いた。センサーの基板に厚さ1.2～1.5mm,76×26mmの形状のMicro Slide Glass(Matsunami)を用いた。酵素を固定化する担体には直径が100,umのガラスビーズ(井内)を用いた。また,基板に薄膜を蒸着するために蒸着装置(昭和小型真空蒸着装置)を使用した。フォトファブリケーションのための装置として,レジストを塗布するためにスピンコーター(IH-DX,MIKASA),ベイクするためのオ一プン(DK300,Yamato),露光するためのマスクアライナー(MUB3,KARLSUSS)を使用した。ガラスビーズの配列確認に実体顕微鏡(OPTIPHOT-2,Nikon)を用いた。発光反応を検出するために化学発光検出器(ARGUS50,浜松ホトニクス)を用いた。作製したレジスト形状を測定する装置に表面粗さ計(Dektak3030,fi本真空技術株式会社)を用いた。
2.2.センサーの作製方法
本研究で作製し,使用したセンサー概略をFigure2.1に示す。構成は酵素を固定化するための担体であるガラスビーズ,それを配置するためのガラス基板からなっている。担体の形状は,直径が100μmで水に沈澱可能である。基板はフォトファブリケーションにより作製し,担体が入るためのチャンバー,またその中に電極が配線された構造になっている。この担体と基板を組み合わせることによりセンサーとして利用する。このセンサーの検出方法は,酵素触媒反応によっておこる蛍光検出と酸化還元反応による電気検出の複合的検出を可能にすることを考えた。以下に,センサー作製の手順を示す。
2.2.1センサー基板の作製
センサー基板の作製をFigure2,2と以下に示す。
[1]基板の洗浄
ガラス基板を中性洗剤(コンタミノン,Wako)を用いて洗浄し,比較的大きな汚染物質を取り除いた。次に,基板を超純水に浸し,5分間超音波洗浄し,極性汚れを取り除いた。さらに,非極性の汚れを取り除くために,IPA(イソプロピルアルコール),アセトン,IPAの順でそれぞれ5分間同じ様に超音波洗浄した。最後に超純水で5分間超音波洗浄した。この後,基板をホットプレートで200QC,10分間加熱し基板に残った水分を取り除いた。
[2]電極の蒸着
蒸着装置を用いて107～106torrの真空状態で,センサー電極を作製するためにクロム200A,金1000aをガラス基板に蒸着した。
[3]電極作製のためのレジストパターン作製
フォトマスクをAdobe Illustratorで作製した(3000dpi相当,山田製版)。スピンコータを用いてネガ型レジストOMR-85を基板上に均一に塗布した。この基板をホットプレートで加熱し,予め作製したマスクパターンを用いて,露光し,現像することにより任意のレジストパターンを得た。
(OMR…85)べ一ク:ホットプレート200℃15分HMDS塗布:スピナー初速:300rpm 3s, slope:2s,本速:4000rpm 20s, slope:2s終速:6000rpm 2s, slope:2s HMDSプリベーク:ホットプレート110℃3分塗布:スピナー初速:300rpm 3s, slope:2s,本速:4000rpm 20s, slope:2s終速:6000rpm 2s, slope:2sソフトベイク:ホットプレート110℃ 3分露光:マスクアライナー0.4s(露光装置の出力が13.lmWの時)ポストベイクニオーブン125℃20分現像:OMR-85現像液2分OMR-85リンス1分純水1分OMR-85除去:クリーンストリップ120℃ 1分ストリップリンス1分アセトン1分水洗い
[4]エッチングによる電極形状の作製
レジストパターンが形成してある基板を金,クロムの溶解液(エッチング液)に5分間浸した。基板上のレジストを剥離することにより,電極パターンを作製した。金はエッチング液(ヨウ化カリウム40g,よう素10g,水400mL),クロムはエッチング液(水酸化ナトリウム40g,フエリシアン化カリウム1008,水400mL)を用いた。
[5]レジストパターンによるセンサーチャンバーの作製
ネガ型レジストSU-8(50) を用い,[3]でおこなった謬工程手順でレジストパターンを作製した。以下にそれぞれの」二程での設定値を記した。
(SU-8)べ一ク:ホットプレート200℃15分塗布:スピナー初速度:500rpm 10s, slope:10s,本速度:2000rpm 20s, slope:5sポストベイク:ホットプレート100℃20分露光:マスクアライナー17s(露光装置の出力が13,lmWの時)ハードベイク:ホットプレート100℃15分以.上の[1]～[5]のステップを踏むことにより,センサー基板を作製した。
2.2.2ガラスビーズへの酵素固定化酵素のガラスビーズへの固定化方法をFigure2.3に示す。直径約100μmのガラスビーズを200メッシュのふるいにかけたのち,10%水酸化カリウム溶液中,室温で数時間撹絆し,洗浄した。これを10%γ一APTESトルエン溶液で終夜還流し,濾紙にとってトルエンで洗浄した。さらに115℃で4時間加熱したのち,2.5%グルタルアルデヒド(GA)を含むリン酸緩衝液(pH7.1)中で1時間反応させた。洗浄後,10%PODを含むリン酸緩衝溶液中に終夜浸し固定化した。
2.3担体に固定化した酵素活性の測定方法グルコースオキシダーゼ(GOD),ペルオキシダーゼ(POD),およびその両方固定化した3種類のビーズを準備した。P一ヨードブSノール0.13mM,ルミノール1mMの混合溶液の中に基板を浸し,その基板のチャンバー内にそれぞれのビーズを入れた。この溶液中にグルコースを入れるとFigure2.4(1)の2段階の酵素反応が起こりGODとPODを固定化したビーズの発光が起こることを確認した。また,過酸化水素を入れるとFigure2.4(2)の反応が起こり,GODとPODを固定化したビーズ,PODのみを固定化したビーズで発光が起こることを確認した。なお,発光は2次元高感度化学発光系計測システムにて測定した。
3.結果および考察
3.1センサー基板の作製
作製したセンサー基板の写真をFigure2.5に示す。
作製手順[2]において,蒸着の真空度は高い程,作製膜や装置のチャンバー内の蒸着による汚れを防ぐためにもよいか,排気に時間かかかるため,真空度は約107torrにした。なお,作製手順[4]のエッチング速度は,レジストパターンの大きさ形状によって異なってくる。
3.2酵素固定化の検討
今回用いた生体材料は酵素であり,固定化においては,酸素の表面密度や,酵素の配向性などが重要になってくる。すなわち,生体材料は十分な量固定化されなければ実用的に利用できない。また,固定化によって立体構造が変化し,酵素としての機能が働かなかったり,配向が適当でないと,活性部位が露出していない状態になることが考えられる。このため,本研究で使用した酵素固定化担体か反応触媒として利用可能であることをルミノール発光により検討した。ペルオキシダーゼの活性の最適pHは6,0～6.5であり,ルミノールの発光の最適pHは10～11である。このためまず,使用する反応系での最適なpHを求めた。Figure2.6は1mMルミノール5ml,0.13mMパラヨードフェノール1ml,1mM過酸化水素0.2mIの混合溶液中にペルオキシダーゼを固定化した酵素を入れ,ルミノール発光を2次元高感度化学発光系計測システムにて測定した結果である。pH7.5,8.0,8.5の3種類を調べた。pH7.5で発光は得られず,pH8.0,8.5の両方で発光が測定されたが,Figure2.6より,pH8.0でより高い発光が得られていることがわかった。このため,以後のルミノール発光を利用した実験ではpH8.0でおこなった。
3.3センサーの集積化
センサーの集積化によって,異なる酵素が固定化してあるチャンネル間の距離が短くなり,複数のチャンネルの相互作用が問題となることが考えられる。グルコースオキシダーゼ(GOD),ペルオキシダーゼ(POD),とその両方固定化した3種類のビーズを用いて,酵素の触媒反応によるルミノール発光を測定した。Figure2.7のBのビーズで起こる反応は,Figure2.4の(1)のPODとGODによる2段階反応式である。このように,Figure2.7のCのビーズで起こる反応は,Figure2.4の(2)と対応している。この実験の結果より,同じ担体に2種類の酵素を固定化した場合は,グルコースを加えてルミノール発光がBのビーズから得られたことから,2段階の酵素反応を行なえることがわかった。また,もし,Bのビーズ.上で生成した過酸化水素がCのビーズまで十分な量で拡散すれば,C上でも化学発光が見られるはずである。しかし,Cでは化学発光が見られていない。このことから,担体が図のように離れている場合に相互作用は起こらないことがわかった。このように,同じルミノールの発光反応溶液中で2種類の反応が検出できることが示された。
3.4センサー電極による還元電位測定
Figure2.8は作製したセンサーを50mM,100m1リン酸緩衝液中に浸した。この中に100mMの過酸化水素を40秒間隔で0.5m1づつ加えていき,酸化還元電流値をクロノアンペロメトリーで測定した結果である。この結果により,本研究で作製した,センサーチップを用いて過酸化水素の濃度測定ができることが分かった。このセンサーチップのチャンバー内で,過酸化水素が生成する反応が起きれば電気信号として検出できることがわかる。グルコースのGODによる触媒反応で過酸化水素が生成することがわかっている。したがって,GODを固定化したビーズをセンサーのチャンバー内に配置すれば,グルコースの電気化学的検出が可能になると考え実験を行なってみた。しかし,この実験結果からは応答が得られなかった。この原因として,反応によって生成される過酸化水素の濃度が低いことや,配置されたガラスビーズと電極との距離が離れていたことが考えられた。したがって電気化学的な検出をするためには,電極上に直接生体材料を固定化する必要があると考えられた。
4.結言
以下に本研究で得られた結果をまとめる。
(1)厚膜用レジストSU-8を用いてレジストパターンを作製した。膜厚が約80μmのものが得られた。レジスト塗布を繰り返すことによってさらに厚い膜を形成することができると考えられる。
(2)水溶液中で100μmのガラスビーズをSU-8で作製したレジストパターンのウェルにビーズの重力によって配置することができた。
(3)ガラスビーズ担体にγ一APTESの化学修飾を用いて酵素を固定化することができた。また,この固定化した酵素が触媒反応として使用できることがルミノール発光によって確認された。
(4)酵素をビーズに固定化し,それぞれ別々のセンサーチャンバーに配置することによって,反応の相互作用が起こらなかったことから,それぞれのチャンバーにおいて孤立した反応系を作ることができた。これを集積型バイオセンサーに応用できることがわかった。
以上より,酵素をガラスビーズに固定化し,今回の実験のようにパターン状にビーズを配置させれば,異なる反応リアクターとして利用可能であることがわかり,集積型バイオセンサーに応用できることが示唆された。