2003年[ 技術開発研究助成 ] 成果報告 ： 年報第17号
アントラキノンーDNA修飾電極によるDNAセンシング
概要
1.はじめに
ポストゲノム時代を迎え、ゲノム研究の重点は塩基配列の決定を主目的とする構造ゲノミクスから、プロテオーム解析、cDNA解析、バイオインフォマティクス等の機能ゲノミクスに移行し、世界的に精力的な研究が行われている。遺伝子構造解析から得られる情報は遺伝子診断や遺伝子治療、新薬開発、生命のメカニズムの解明などにとってきわめて重要であり、したがって遺伝子構造解析や塩基配列の識別や検出の方法は基本技術として重要である。特に、固相表面に既知のシーケンスを有するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ化したDNAチップは、様々な組織や環境下での多数の遺伝子発現をパラレルに分析することができ、特定の塩基配列を迅速かつ簡便に調べる検出ツールとして広く利用されている。しかし現在の蛍光を基盤としたDNAチップは手軽さやコストの面で負担が大きく、再現性や感受性においても問題が残っており、より簡便で効率の良い検出法が必要とされている。
近年、DNAの特定の塩基配列を検出する新しい手法として電気化学的応答を基盤とした検出法が注目されており、様々なアプローチが試みられてきた。この方法は電気化学的に活性な分子と特定のDNA配列との相互作用に起因する電気化学的応答の変化をモニターすることにより行われる。これまでに、レドックス活性をもつ化学種を外部からのメディエーターとして利用する試みが主に報告されてきた1)～6)。一方、別のアプローチとして、レドックス活性分子をオリゴヌクレオチドの特定の部位に共有結合で導入し、電気化学的プローブとして用いる方法も報告されている7)～10)、この方法では、DNA2本鎖中へのレドックス活性種の導入部位を目的に応じて設定することが可能である。
われわれは、レドックス活性種としてアントラキノンに着目し、アントラキノンをメチレンリンカーを介してDNAの糖部2'位に共有結合で導入したオリゴヌクレオチド誘導体を表面に固定化した金電極を作製し、特定の塩基配列との相互作用に関連する電気化学的性質を明らかにすることを目指した。すでに糖部2'位にメチレンリンカーを介してアントラキノンを導入したオリゴヌクレオチド誘導体が相補鎖DNAあるいはRNAとアントラキノン基のインターカレーションに由来する高い親和性を有することを明らかにしている11)'12)。電気化学活性とインターカレーターの両性質を合わせもつアントラキノンを導入したオリゴヌクレオチド誘導体が相補鎖と2本鎖を形成する際に、インターカレーションによってアントラキノンの周辺環境や相互作用に変化が生じ、アントラキノンの電気化学特性が変化すれば、特定の塩基配列とのハイブリダイゼーションを認識する電気化学的プローブとして用いることができる。
ここでは、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体を表面に固定化した金電極について電気化学的諸特性を検討した結果について報告する13)、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体2本鎖を固定化した金電極において、1本鎖の場合よりも速い電子移動速度を示すことが確認され、電子移動速度の差を利用して相補的DNAとのハイブリダイゼーションを認識する新しい検出法として期待できる有用な結果が得られた。
2.アントラキノン修飾DNAを固定化した金電極
アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体[AQ-ODN]を表面に固定化した金電極を作製し、その電気化学的挙動を検討した。
AQ-ODNはオリゴヌクレオチド中のウリジン糖部2'位にアントラキノン基を共有結合で導入したオリゴヌクレオチド誘導体であり、アントラキノン基が核酸塩基間にインターカレーションすることにより相補鎖と安定な2本鎖(Tm=60°C)を形成することが明らかにされている12)。AQ-ODNの3'末端へのジスルフィド基の導入は、1に示した化学構造を有する固相担体をDNA自動合成機に適用することにより行った。末端にジスルフィド基を有するアントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体[AQ-oDN-derivative]および相補鎖[Target]のシーケンスをTable1に示し、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体におけるアントラキノン導入部位の化学構造をⅡに示した。このように合成されたAQ-ODN誘導体は、アルキルリンカーを介してオリゴヌクレオチド末端に導入されたジスルフィド基により、電極表面においてAu-S間の結合を形成し、自己組織化することで単分子層を形成する。アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体を固定化した金電極の構造をIHに示した。
3.アントラキノンモノマー(IV)を固定化した金電極のレドックス応答
アントラキノン基と電極表面間の距離がより近い修飾単分子層の系の評価と、金電極とジスルフィド基の結合能力の確認のために、ジスルフィド基を有するアントラキノンモノマーを固定化した金電極(ガラス基板)を用いてサイクリックボルタンメトリー測定を行った。ジスルフィド基を有するアントラキノンモノマーの化学構造をIVに示し、アントラキノンモノマーを修飾した金電極の構造をVに示した。
また、得られたボルタモグラムをFig.1に示した。ボルタモグラムにはアントラキノン基に由来するレドックス応答が観察されたが、還元ピーク電流値Ipcは、リン酸緩衝溶液中で測定したAQ-ODN修飾金電極のIpcと比較して10倍以上大きい値を示した。このことは、修飾分子が低分子であるために表面修飾密度が高いことや、アントラキノン基と電極表面間の距離が近いことに起因すると推察される。また、走査速度に対するIpcのプロットをFig.2に示した。得られたプロットはほぼ原点を通る直線となり、電極表面に固定された化学種に由来するレドソクス反応の特徴を示した。
さらに、△Eは非常に大きい値を示し、レドックス反応が遅い電子移動プロセスを経ていることが示唆される。また、還元ピーク上にショルダーが観察されたが、これは走査速度の増大にともなって減少し、一部の還元されたAQH2とAQによって形成されるキンヒドロン型の電荷移動錯体の形成に由来するものであると推察される。
4.酸化脱離による表面修飾密度の定量
金電極表面に固定化された化学種の表面修飾密度を概算するために、0.5M KOH水溶液を支持電解質溶液としてサイクリックボルタンメトリーを行い、金表面からの修飾単分子層の酸化脱離を行った。Porterらの報告によれば、電極表面に修飾されたアルキルチオール単層の酸化脱離は、pH>7の条件下では(1)式のように表される。
アントラキノンモノマーを修飾した金電極,AQ・ODN(ss)修飾金電極、およびAQ-ODN(ds)修飾金電極(以上すべてガラス基板)について得られた酸化脱離についてのボルタモグラムをFig.3a)～c)に示した。すべての修飾金電極について、最初の電位走査での酸化波上に、修飾単分子層の酸化脱離に由来するピークが観察された。この修飾単分子層の脱離に由来するピークは2回目の電位走査では観察されず、金表面の酸化に由来するブロードな応答のみが観察された。また、還元波において観察されるピークは、酸化側の走査において生成した金オキシドの還元に由来する。従って、最初の走査での酸化ピークに相当する電荷密度と還元ピークに相当する電荷密度の差から、修飾層の脱離に要した電荷密度を求めることができる。Hartwichらは、Au・S-(CH2)2-NH2単分子層について、酸化脱離に要した電荷密度400±100μCcm'2から表面修飾密度を概算し、6.5±1.5×1014thiols cm-2であることを報告している。同様に、アントラキノンモノマーを修飾したn極、AQ-ODN(ss)修飾金電極、およびAQ-ODN(ds)修飾金電極についての表面修飾密度は,それぞれ3.5×1013thiols cm-2、5.5×1012molecules cm-2、4×1012molecules cm-2と概算された。AQ-ODN修飾金電極について得られた表面修飾密度は、末端の塩基にレドックス活性分子を有するオリゴヌクレオチドを修飾した金電極について報告されている表面修飾密度の値と良く一一致した。
5.AQ-ODN1本鎖を固定化した金電極表面のAFM解析
アニール処理を施した金薄膜上にAQ-ODN1本鎖を固定化した金電極(マイカ基板)表面のAFM像をFig.4に示した。電極表面にはいくつかの粒状の隆起が見られ、Fig.4に示した修飾前の電極表面と比較して明らかな変化を示した。これは、電極表面に固定化されたAQ-ODNに由来するものであると推察される。
6.AQ-ODN修飾金電極(マイカ基板)のレドックス応答
アニール処理を施した金電極(マイカ基板)を用いてAQ-ODN(ss)修飾金電極およびAQ-oDN(ds)修飾金電極を作製し、サイクリックボルタンメトリー測定を行った。
得られたボルタモグラムをFig.5a)、b)に示す。両方の電極において、アントラキノン基のレドックス応答に由来するピークが観察された。また、Fig.6にそれぞれの電極における還元ピーク電流値Ipcの走査速度に対するプロットを示した。得られたプロットはほぼ原点を通る直線となり電極表面に固定された化学種のレドックス反応の特徴を示した。さらに、ピーク電位差△EはAQ-ODN(ds)修飾金電極においてAQ-ODN(ss)修飾金電極よりも小さい値を示すことが確認された(Fig.7)。Lavironらによって、ピーク電位差△Eと電子移動速度定数との関連性が報告されており、その関係式は(2)式のように表される。
ここで用いられる記号はそれぞれ、ks:電子移動速度定数(S-1)、n:反応電子数,F:ファラデー定数、v:走査速度(V!s)、△E:ピーク電位差(V)、α=0.5(Ipa≒Ipcのとき)である。この関係式を用いて、AQ-ODN(ss)修飾金電極およびAQ-ODN(ds)修飾金電極における電子移動速度定数は、それぞれ9.6s冒1、15,0s'1と計算され、AQ・ODN(ds)修飾金電極はAQ-ODN(ss)修飾金電極よりも速い電子移動速度を示すことが確認された。また、同じ基板を用いて新たに作製したAQ・ODN修飾金電極での追実験においても、同様の結果を再現した。追実験におけるAQつDN(ss)修飾金電極およびAQ-ODN(ds)修飾金電極についての電子移動速度定数は、それぞれ7.1s'1、12.4s-1と計算された。
以上のことから、AQ-ODN修飾金電極は,相補鎖DNAと2本鎖を形成することにより、1本鎖に比べてより速い電子移動速度を示すことが確認された。本研究において明らかにされたAQ-ODN修飾金電極のこのような電気化学的性質は、電子移動速度の差を利用してハイブリダイゼーションの検出を行う新しい方法を提示する。
ポストゲノム時代を迎え、ゲノム研究の重点は塩基配列の決定を主目的とする構造ゲノミクスから、プロテオーム解析、cDNA解析、バイオインフォマティクス等の機能ゲノミクスに移行し、世界的に精力的な研究が行われている。遺伝子構造解析から得られる情報は遺伝子診断や遺伝子治療、新薬開発、生命のメカニズムの解明などにとってきわめて重要であり、したがって遺伝子構造解析や塩基配列の識別や検出の方法は基本技術として重要である。特に、固相表面に既知のシーケンスを有するオリゴヌクレオチドをマイクロアレイ化したDNAチップは、様々な組織や環境下での多数の遺伝子発現をパラレルに分析することができ、特定の塩基配列を迅速かつ簡便に調べる検出ツールとして広く利用されている。しかし現在の蛍光を基盤としたDNAチップは手軽さやコストの面で負担が大きく、再現性や感受性においても問題が残っており、より簡便で効率の良い検出法が必要とされている。
近年、DNAの特定の塩基配列を検出する新しい手法として電気化学的応答を基盤とした検出法が注目されており、様々なアプローチが試みられてきた。この方法は電気化学的に活性な分子と特定のDNA配列との相互作用に起因する電気化学的応答の変化をモニターすることにより行われる。これまでに、レドックス活性をもつ化学種を外部からのメディエーターとして利用する試みが主に報告されてきた1)～6)。一方、別のアプローチとして、レドックス活性分子をオリゴヌクレオチドの特定の部位に共有結合で導入し、電気化学的プローブとして用いる方法も報告されている7)～10)、この方法では、DNA2本鎖中へのレドックス活性種の導入部位を目的に応じて設定することが可能である。
われわれは、レドックス活性種としてアントラキノンに着目し、アントラキノンをメチレンリンカーを介してDNAの糖部2'位に共有結合で導入したオリゴヌクレオチド誘導体を表面に固定化した金電極を作製し、特定の塩基配列との相互作用に関連する電気化学的性質を明らかにすることを目指した。すでに糖部2'位にメチレンリンカーを介してアントラキノンを導入したオリゴヌクレオチド誘導体が相補鎖DNAあるいはRNAとアントラキノン基のインターカレーションに由来する高い親和性を有することを明らかにしている11)'12)。電気化学活性とインターカレーターの両性質を合わせもつアントラキノンを導入したオリゴヌクレオチド誘導体が相補鎖と2本鎖を形成する際に、インターカレーションによってアントラキノンの周辺環境や相互作用に変化が生じ、アントラキノンの電気化学特性が変化すれば、特定の塩基配列とのハイブリダイゼーションを認識する電気化学的プローブとして用いることができる。
ここでは、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体を表面に固定化した金電極について電気化学的諸特性を検討した結果について報告する13)、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体2本鎖を固定化した金電極において、1本鎖の場合よりも速い電子移動速度を示すことが確認され、電子移動速度の差を利用して相補的DNAとのハイブリダイゼーションを認識する新しい検出法として期待できる有用な結果が得られた。
2.アントラキノン修飾DNAを固定化した金電極
アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体[AQ-ODN]を表面に固定化した金電極を作製し、その電気化学的挙動を検討した。
AQ-ODNはオリゴヌクレオチド中のウリジン糖部2'位にアントラキノン基を共有結合で導入したオリゴヌクレオチド誘導体であり、アントラキノン基が核酸塩基間にインターカレーションすることにより相補鎖と安定な2本鎖(Tm=60°C)を形成することが明らかにされている12)。AQ-ODNの3'末端へのジスルフィド基の導入は、1に示した化学構造を有する固相担体をDNA自動合成機に適用することにより行った。末端にジスルフィド基を有するアントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体[AQ-oDN-derivative]および相補鎖[Target]のシーケンスをTable1に示し、アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体におけるアントラキノン導入部位の化学構造をⅡに示した。このように合成されたAQ-ODN誘導体は、アルキルリンカーを介してオリゴヌクレオチド末端に導入されたジスルフィド基により、電極表面においてAu-S間の結合を形成し、自己組織化することで単分子層を形成する。アントラキノン修飾オリゴヌクレオチド誘導体を固定化した金電極の構造をIHに示した。
3.アントラキノンモノマー(IV)を固定化した金電極のレドックス応答
アントラキノン基と電極表面間の距離がより近い修飾単分子層の系の評価と、金電極とジスルフィド基の結合能力の確認のために、ジスルフィド基を有するアントラキノンモノマーを固定化した金電極(ガラス基板)を用いてサイクリックボルタンメトリー測定を行った。ジスルフィド基を有するアントラキノンモノマーの化学構造をIVに示し、アントラキノンモノマーを修飾した金電極の構造をVに示した。
また、得られたボルタモグラムをFig.1に示した。ボルタモグラムにはアントラキノン基に由来するレドックス応答が観察されたが、還元ピーク電流値Ipcは、リン酸緩衝溶液中で測定したAQ-ODN修飾金電極のIpcと比較して10倍以上大きい値を示した。このことは、修飾分子が低分子であるために表面修飾密度が高いことや、アントラキノン基と電極表面間の距離が近いことに起因すると推察される。また、走査速度に対するIpcのプロットをFig.2に示した。得られたプロットはほぼ原点を通る直線となり、電極表面に固定された化学種に由来するレドソクス反応の特徴を示した。
さらに、△Eは非常に大きい値を示し、レドックス反応が遅い電子移動プロセスを経ていることが示唆される。また、還元ピーク上にショルダーが観察されたが、これは走査速度の増大にともなって減少し、一部の還元されたAQH2とAQによって形成されるキンヒドロン型の電荷移動錯体の形成に由来するものであると推察される。
4.酸化脱離による表面修飾密度の定量
金電極表面に固定化された化学種の表面修飾密度を概算するために、0.5M KOH水溶液を支持電解質溶液としてサイクリックボルタンメトリーを行い、金表面からの修飾単分子層の酸化脱離を行った。Porterらの報告によれば、電極表面に修飾されたアルキルチオール単層の酸化脱離は、pH>7の条件下では(1)式のように表される。
アントラキノンモノマーを修飾した金電極,AQ・ODN(ss)修飾金電極、およびAQ-ODN(ds)修飾金電極(以上すべてガラス基板)について得られた酸化脱離についてのボルタモグラムをFig.3a)～c)に示した。すべての修飾金電極について、最初の電位走査での酸化波上に、修飾単分子層の酸化脱離に由来するピークが観察された。この修飾単分子層の脱離に由来するピークは2回目の電位走査では観察されず、金表面の酸化に由来するブロードな応答のみが観察された。また、還元波において観察されるピークは、酸化側の走査において生成した金オキシドの還元に由来する。従って、最初の走査での酸化ピークに相当する電荷密度と還元ピークに相当する電荷密度の差から、修飾層の脱離に要した電荷密度を求めることができる。Hartwichらは、Au・S-(CH2)2-NH2単分子層について、酸化脱離に要した電荷密度400±100μCcm'2から表面修飾密度を概算し、6.5±1.5×1014thiols cm-2であることを報告している。同様に、アントラキノンモノマーを修飾したn極、AQ-ODN(ss)修飾金電極、およびAQ-ODN(ds)修飾金電極についての表面修飾密度は,それぞれ3.5×1013thiols cm-2、5.5×1012molecules cm-2、4×1012molecules cm-2と概算された。AQ-ODN修飾金電極について得られた表面修飾密度は、末端の塩基にレドックス活性分子を有するオリゴヌクレオチドを修飾した金電極について報告されている表面修飾密度の値と良く一一致した。
5.AQ-ODN1本鎖を固定化した金電極表面のAFM解析
アニール処理を施した金薄膜上にAQ-ODN1本鎖を固定化した金電極(マイカ基板)表面のAFM像をFig.4に示した。電極表面にはいくつかの粒状の隆起が見られ、Fig.4に示した修飾前の電極表面と比較して明らかな変化を示した。これは、電極表面に固定化されたAQ-ODNに由来するものであると推察される。
6.AQ-ODN修飾金電極(マイカ基板)のレドックス応答
アニール処理を施した金電極(マイカ基板)を用いてAQ-ODN(ss)修飾金電極およびAQ-oDN(ds)修飾金電極を作製し、サイクリックボルタンメトリー測定を行った。
得られたボルタモグラムをFig.5a)、b)に示す。両方の電極において、アントラキノン基のレドックス応答に由来するピークが観察された。また、Fig.6にそれぞれの電極における還元ピーク電流値Ipcの走査速度に対するプロットを示した。得られたプロットはほぼ原点を通る直線となり電極表面に固定された化学種のレドックス反応の特徴を示した。さらに、ピーク電位差△EはAQ-ODN(ds)修飾金電極においてAQ-ODN(ss)修飾金電極よりも小さい値を示すことが確認された(Fig.7)。Lavironらによって、ピーク電位差△Eと電子移動速度定数との関連性が報告されており、その関係式は(2)式のように表される。
ここで用いられる記号はそれぞれ、ks:電子移動速度定数(S-1)、n:反応電子数,F:ファラデー定数、v:走査速度(V!s)、△E:ピーク電位差(V)、α=0.5(Ipa≒Ipcのとき)である。この関係式を用いて、AQ-ODN(ss)修飾金電極およびAQ-ODN(ds)修飾金電極における電子移動速度定数は、それぞれ9.6s冒1、15,0s'1と計算され、AQ・ODN(ds)修飾金電極はAQ-ODN(ss)修飾金電極よりも速い電子移動速度を示すことが確認された。また、同じ基板を用いて新たに作製したAQ・ODN修飾金電極での追実験においても、同様の結果を再現した。追実験におけるAQつDN(ss)修飾金電極およびAQ-ODN(ds)修飾金電極についての電子移動速度定数は、それぞれ7.1s'1、12.4s-1と計算された。
以上のことから、AQ-ODN修飾金電極は,相補鎖DNAと2本鎖を形成することにより、1本鎖に比べてより速い電子移動速度を示すことが確認された。本研究において明らかにされたAQ-ODN修飾金電極のこのような電気化学的性質は、電子移動速度の差を利用してハイブリダイゼーションの検出を行う新しい方法を提示する。